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1.
[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础. 相似文献
2.
为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。 相似文献
3.
《河北农业大学学报》2015,(4)
为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白基因在动物细胞中同步表达水平,本试验依据动物偏爱的密码子对GP5和M蛋白基因分别进行了密码子优化,并利用本室构建的含内部核蛋白体进入位点(IRES)载体pcDNA-IRES,将密码子优化的和野生型的GP5基因和M蛋白基因分别插入到IRES的上下游,分别构建成GP5与His-标签融合和M蛋白与Myc-标签融合的密码子优化的和野生型的GP5/M双基因表达载体pcDNA-OpGP5/His-IRES-OpM/MH和pcDNA-GP5/His-IRES-M/MH,将双基因表达载体转染HEK293T细胞使其表达,通过Western blot检测,比较GP5和M蛋白在真核细胞的表达水平。结果显示,密码子优化可明显提高GP5和M在HEK293T细胞中的表达水平,本试验为GP5和M蛋白功能的研究提供了有利条件。 相似文献
4.
为成功表达PRRSV GZJL株GP5蛋白,本研究设计合成一对引物,并以PCR方法从阳性重组质粒pMD18-T-GP5中扩增得到PRRSV GZJL株GP5基因片段中的79～600 bp即dGP5.将dGP5基因连接至原核表达载体pET-32a(+),并转化入表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,阳性... 相似文献
5.
猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。 相似文献
6.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因,并进行了测序分析,根据0RF5的结构特点,进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5),并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体,构建了重组质粒pKG-ns5,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD,并具有反应活性,这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础. 相似文献
7.
通过对PRRSV Hn-1/06株ORF5基因序列分析,设计删除信号肽和跨膜功能区的ORF5序列的3对引物,应用重叠延伸PCR以PTG19-T-ORF5质粒为模板进行扩增目的片段,得到长度为410 bp的片段。然后将此基因亚克隆到原核表达载体PET32a,经筛选获得了阳性重组质粒PET32a-ORF5abc,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为34 kD的融合蛋白GP5abc-His,Western blotting检测结果证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
8.
PRRSV浙江株ORF5基因的原核表达与免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列.以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5.将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入E.coli菌株BL21.经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白.结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达.纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应. 相似文献
9.
[目的]克隆PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体。[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5。以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定。[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定,结果与预期一致,证实重组质粒构建成功。[结论]成功构建了PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础。 相似文献
10.
【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。 相似文献
11.
[目的]实现PRRSV GP5与GP4蛋白在同一载体中表达各自编码的蛋白,发挥GP5蛋白在体液免疫中的优势和GP4蛋白在信号转导中的作用。[方法]利用RT-PCR扩增出GP5与GP4基因,克隆到pIRESneo载体的多克隆酶切位点及新霉素磷酸转移酶位点中,用XhoⅠ和NruⅠ双酶切含GP5和GP4基因的表达盒,将此表达盒克隆到犬2型腺病毒E3区缺失性载体pPolyⅡ-CAV-2-△E3中,以AsⅠc和PmeⅠ双酶切进行鉴定。[结果]将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,可以诱导产生较强的体液免疫应答（ELISA抗体和中和抗体）。[结论]该重组腺病毒具有较好的免疫原性,可为研制有效的亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
12.
LI Guo-xin QIU Hua-ji HAN Cheng-gang HAN Ling-xia ZHOU Yan-jun CHEN Yan LI Ji-chang TONG Guang-zhi 《中国农业科学(英文版)》2006,5(3):234-240
Somatostatin （SS） is a hormone that inhibits the secretion of growth hormone. Immunization against SS can promote the growth of animals. This paper described the effects of DNA immunization on the growth and antibody response in mice and pigs immunized with a plasmid DNA encoding SS fused with GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）. A fragment of 180 bp encoding partial SS gene was amplified by PCR from the genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells of pigs, and cloned as a fusion gene with PRRSV GP5 in plasmid pISGRTK3. Three times of immunization with the resulting plasmid pISG-SS/GP5 induced anti-GP5 antibodies in BALB/c mice and pigs, as demonstrated by GP5-specific ELISA and immunoblotting. Compared with pigs immunized with empty vector pISGRTK3, the growth performance of pigs immunized with pISG-SS/GP5 was increased by 11.1% on the 13th week after the last vaccination. The results indicated the plasmid DNA encoding SS and PRRSV GP5 fusion gene elicited anti-GP5 antibodies and improved the growth performance of immunized pigs. 相似文献
13.
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因疫苗的构建及免疫小鼠试验 总被引：3，自引：0，他引：3
参照已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5蛋白基因序列,设计并合成1对引物,以RT-PCR方法扩增出PRRSV的GP5基因片段(603 bp)。回收目的基因片段,克隆到pMD18-T载体内构建成重组质粒pMD18T-G。经酶切鉴定、测序正确后,再回收目的基因片段,克隆到真核表达载体pIRES-neo内,经单酶切和双酶切鉴定,成功构建基因疫苗表达载体pIRES-G。免疫小鼠试验表明,2次免疫后抗体水平显著提高,但总的抗体水平体低于灭活苗。 相似文献
14.
猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力 总被引：6，自引：4，他引：2
通过分子克隆技术构建了表达猪白细胞介素(IL)-15及猪繁殖呼吸综合症(PRRSV)病毒GP5基因重组核酸疫苗。以小鼠为试验模型,利用猪IL-15作为分子佐剂并检测其对表达PRRS病毒GP5基因核酸疫苗的免疫增强作用。结果表明,猪IL-15与GP5试验组小鼠抗体水平和T淋巴细胞亚群数量均高于PBS对照组及GP5基因单独免疫组,表明猪IL-15对核酸疫苗可有效增强PRRS病毒GP5基因的免疫效果,证实了其佐剂效应。 相似文献
15.
为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。 相似文献
16.
《农业科学学报》2016,(8)
The glycoprotein 5(GP5) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) is a multi-functional protein that plays important roles in virus assembly,entry and viral anti-host responses.In the present study,we investigated the cellular binding partners of GP5 by using lentivirus transduction coupled with immunoprecipitation and mass spectrometry.There were about 40 cellular proteins identified with high Confidence Icons by MS/MS.Ingenuity Pathway Analysis(IPA)indicated that these proteins could be assigned to different functional classes and networks.Furthermore,we validated some of the interactions by co-immunoprecipitation(Co-IP) and confocal microscopy,including those with mitofilin,a mitochondrial inner membrane protein that might be involved in PRRSV or GP5-induced apoptosis,and calnexin,a protein chaperone that might facilitate the folding and maturation of GP5.The interactome data contribute to understand the role and molecular mechanisms of GP5 in PRRSV pathogenesis. 相似文献
17.
将构建好的表达质粒pET-E和pET-N转化到大肠杆菌BL-21中,通过诱导剂IPTG的诱导,在原核表达系统中得到了高效表达,重组蛋白的分子量分别为39 KDa和31 KDa左右。通过Western-blot蛋白免疫印记法检测蛋白活性,发现两种原核表达重组蛋白均能与PRRSV阳性血清发生反应,具有生物学活性,这就为下一步目的蛋白的纯化、蛋白高级结构的研究以及以GP5和N蛋白为抗原ELISA诊断方法的建立奠定基础。 相似文献