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根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。 相似文献
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以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增.将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810 bp的产物.VP1基因和 pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础. 相似文献
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牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,应用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4。测序结果表明:克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100%;用SacI和SmaI对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段反身插入到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体。 相似文献
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植物果实特异性启动子E8基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
采用高盐低pH值法、分步离心法、SDS法、CTAB法、改良CTAB法提取毛粉802番茄幼苗基因组DNA,其中改良CTAB法提取的DNA效果最好,以此DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,得到了预期大小的片段,将目的片段回收,克隆进pMD18-T Simple Vector载体,经PCR及酶切检测具有与目标片段长度相符的插入片段,构建的重组pMD18-E8载体经测序结果分析显示,番茄果实特异性E8启动子序列具有高度保守性,与GenBank上发表的E81.1启动子同源性为99.1%,说明成功获得了果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因桃果实中特异性表达做准备。 相似文献
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甘蓝型油菜CONSTANS目的基因的克隆以NCBI上公布的序列设计全长扩增引物进行扩增。对目的基因片段测序并进行酶切位点分析,设计酶切引物(BamHⅠ,SacⅠ),通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pBI121上,PCR鉴定结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功构建。将过表达载体转化感受态EHA105细胞,通过拟南芥花絮侵染T0代种子,用含卡拉霉素(50 mg/L)的MS固体培养基进行筛选,获得阳性植株。通过PCR鉴定,结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功导入拟南芥中,获得转基因阳性苗12株,为下一步基因功能分析做好了准备。 相似文献
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草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。 相似文献
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抗菌肽是昆虫抵御外界微生物侵染的主要物质。本文利用双酶切将pBI121载体上的植物启动子CaMV35S克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,构建重组表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S。PCR扩增家蚕抗菌肽attacin基因编码区全长并利用T载体成功克隆（GenBank登陆号：GU244351）,然后利用双酶切将attacin 基因亚克隆到pCAMBIA2300-CaMV35S上,通过PCR鉴定,成功构建了attacin基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-attacin。为研究attacin基因在植物抗病性方面的应用奠定基础。 相似文献
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iMyAP基因过表达载体转化甘蓝型油菜 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究以甘蓝型油菜湘油15号叶片cDNA为模版,克隆油菜黑芥子酶协助蛋白iMyAP基因全长CDS,目的片段序列和GenBank上报道的甘蓝型油菜序列iMyAP12-Y10156同源性达到100%。将得到的iMyAP基因片段与pMD19-T载体连接,命名为T-1152。用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切T-1152和pHB载体,回收片段经T4DNA连接酶连接得到iMyAP基因过表达载体pHB-1152。通过农杆菌介导将pHB-1152转化至甘蓝型油菜湘油15号,PCR鉴定显示成功获得2株转基因植株。本实验为进一步研究iMyAP基因的功能奠定了良好的基础。 相似文献
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为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。 相似文献
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根据GenBank中番茄八氢番茄红素脱饱和酶基因（Phytoene desaturase.Pds）的启动子序列（U46919）,设计特异引物,通过巢式PCR从番茄基因组中分离了一段长1790bp的Pds启动子序列。将该片段插入到克隆载体pMD18-T中,转化大肠杆菌后,获得的阳性克隆经测序,结果表明所获得的序列和GenBank（U46919）中登录的序列完全一致 相似文献
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马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性 总被引：1，自引：0，他引：1
通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。 相似文献
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一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。 相似文献
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果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。 相似文献
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菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP3蛋白的原核表达与纯化 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3.将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础. 相似文献
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以感病烟草品种为材料,提取总RNA,根据已报道的eIF4E基因cDNA的序列,在保守区域和差异区域分别设计特异性引物,采用RT-PCR克隆出eIF4E基因的目的片段。以中间载体pKANNIBAL和表达载体pART27为基础,构建成以CaMV35S启动子为驱动的含有“正向eIF4E目的片段-pdk intron-反向eIF4E目的片段”的RNAi烟草表达载体,构建的RNAi载体将抑制eIF4E基因表达,为了解其基因功能和烟草抗病毒育种打下基础。 相似文献