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为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green I实时PCR技术,检测转基因大豆 外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS).结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1％ 的大豆中 的CaMV35S基因,而轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的 特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解 曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL.同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分.巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限, SYBR Green I实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分. 相似文献
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巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR技术,检测转基因大豆外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS)。结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1%的大豆中的CaMV35S基因,而第一轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL。同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分。巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限,SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
随着转基因技术的成熟,转基因生物越来越多,关于转基因生物的争议也越来越受到人们的关注。建立一套能够简便、快速、准确的检测转基因林木的外源基因技术,对转基因林木的研究有重要意义。采用灵敏、快速的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立一套以Bt Cry1Ac或Npt II基因为靶标的转基因林木的检测方法。针对靶标基因的6个区域设计4种特异引物,优化LAMP-PCR反应体系中的各个成分,根据直接观察产物中焦磷酸镁的沉淀情况、Gold View核酸染色剂对其产物染色情况来判断反应结果并与将产物经过1%琼脂糖电泳的情况进行对比。比较LAMP-PCR和常规PCR两种不同检测方法的灵敏度。对转基因杨树不同无性系中多种外源基因进行检测。筛选出了最佳的引物,确定出了最优的反应体系:3 mmol/L Mg2+、1.4 mmol/L Bst、1.4 mol/L Betaine、7:1的10μmol/L内外引物比、2μL10 mmol/L d NTP、以及2μL浓度为200 ng/μL的DNA模板。在PCR仪65℃等温条件下保温90 min,可直接观察到焦磷酸镁的白色沉淀;经过Gold View核酸染色剂染色,可在紫外灯下观察到荧光绿色;经过1%琼脂糖电泳的检测,可观察到清晰的弥散状条带。通过对比试验得出LAMP-PCR的灵敏度比常规PCR要高。对实验室多个转基因杨树无性系目的基因的检测,证明了LAMP-PCR在转基因林木外源基因检测中的较高可靠性。本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测转基因林木,建立了一套更简便、灵敏、快速、可靠的转基因林木的LAMP-PCR检测方法。该技术在恒温65℃的条件下保温90 min即可完成转基因林木的检测,既节省了时间,又降低了成本,为转基因林木的检测研究提供了一种新的技术。 相似文献
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应用复合PCR检测水稻种子的转基因成分 总被引：6，自引：0，他引：6
根据转基因水稻中常用的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、胭脂碱合成酶（NoS）终止子、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、潮霉素磷酸转移酶基因（Hpt）、新霉素磷酸转移酶基因（Nptn）和Bt毒蛋白基因（Bt Cry 1 Ab）的序列，设计合成6对不同的引物，用简单PCR方法检测了水稻种子中的转基因成分，同时建立应用一班PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的复合PCR方法。通过对水稻样品进行PCR扩增，分析、比较复合PCR的检测结果与简单PCR的扩增结果。发现两者结果完全一致。表明复合PCR方法不但可以提高检测效率、降低检测成本，还可以有效防止假阳性，是一种值得推广的方法。 相似文献
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为提高棉花新品种选育过程中外源抗虫基因选择的准确性,以常规非转基因抗虫棉花品种、单价转基因抗虫棉品种、双价转基因抗虫棉品种为试验材料,选择能扩增Bt基因通用引物和棉花内源基因SAD1的引物,建立了抗虫基因的PCR检测方法。利用该方法对常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系进行了检测。结果表明,该方法可明确区分常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系;对高代育种品系进行检测表明40%转基因品系中存在单株不能扩增出预期的特异片段,而在非转基因系冈197中存在8.0%的单株扩增出预期的特异片段。该方法可应用于棉花新品种选育过程中对外源抗虫基因的检测,提高了选择的准确性和目的性。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。 相似文献
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转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测 总被引：3，自引：1，他引：2
采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。 相似文献
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转基因植物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术并以番茄抗坏血酸过氧化物酶apx(ascorbate peroxidase)基因和光诱导的早期蛋白elip(early light inducible protein)基因为内参开展对12株转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测。研究结果表明:常规番茄使用的内参基因apx在樱桃番茄中可能以多拷贝形式存在;以elip基因为内参检测到转基因植株内整合的拷贝数为0~20不等,其中4株在普通PCR检测中存在假阳性,且80%的转基因植株发生了基因重排现象。 相似文献
11.
本研究采用多重PCR方法对与抗番茄黄化曲叶病毒病（tomato yellow leafcurl virus,TYLCV）的Ty-2和Ty-3基因紧密连锁的共显性SCAR标记进行扩增筛选,不同基因型（Ty-2/Ty-2,Ty-2/ty-2,ty-2/ty-2,ty-3/ty-3）的材料扩增出不同长度的特异片段,建立了一种快速检测抗TYLCV基因的技术。利用该技术对22份番茄材料进行检测,同时利用普通PCR对上述材料进行检测,两者结果完全吻合。最后用田间自然发病的方法在大田对这些材料抗性进行验证,符合率达86.4%。 相似文献
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小麦品质性状分子标记多重PCR体系的建立 总被引：2，自引：1，他引：2
小麦高分子量谷蛋白亚基组成、1B/1R易位、籽粒硬度、直链淀粉含量和穗发芽抗性等性状与加工品质密切相关，建立相关性状的多重PCR体系在小麦品质分子育种中具有重要意义。本研究利用现有品质性状基因的分子标记，建立了适合不同品质类型品种评价和分子聚合育种的3个多重PCR体系，并用已知基因的品种（系）进行验证。多重PCR体系Ⅰ包括ω-secalin（1B/1R）、Vp1B3和Pinb-D1b基因的分子标记检测，可用于一般的品质检测；体系Ⅱ包括ω-secalin、Ax2*、Bx17和Dx5 基因的检测，可望用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ包括Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1位点的检测，可用于淀粉品质或糯小麦的选育。每个体系内的引物之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种（系）的结果可靠、重复性好，成本低。3个多重PCR体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，将会提高优质专用小麦品种评价和选育的效率。 相似文献
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Tongfei Lai Yuying Wang Boqiang LiGuozheng Qin Shiping Tian 《Postharvest Biology and Technology》2011,62(2):127-132
Nitric oxide (NO), an important signalling molecule, has shown diverse physiological functions in plants. We investigated physiological responses of harvested tomato fruit (Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig, AC) to NO treatment. NO released by 1 mM sodium nitroprusside (SNP) aqueous solution could effectively retard pericarp reddening of tomato fruit, suppress ethylene production, and influence quality parameters during storage. The activity of antioxidant enzymes in NO-treated tomato fruit was higher in the late storage period compared to the control. RT-PCR analysis showed that expression of six genes related to fruit ripening was regulated by NO treatment, resulting in an increase in resistance of tomato fruit to gray mold rot caused by Botrytis cinerea. Our results demonstrated that application of NO could be a potential method for treating harvested fruit in order to delay ripening, maintain quality and enhance resistance of fruit to fungal pathogens. 相似文献
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抗除草剂棉花LLCOTTON25的多重PCR检测方法 总被引：3，自引：1，他引：2
为了建立1种抗除草剂棉花LLCOTTON25多重PCR检测方法,根据抗除草剂棉花LLCOTTON25分子特征,同时选择棉花内源参照基因(SADI)、花椰菜花叶病毒启动子(P-Ca MV 35S)、根癌农杆菌终止子(T-NOS)和目的基因(bar)4个基因作为多重PCR(Polymerase chain reaction)检测基因,参照国家相关标准中的特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立了可同时检测除内源基因外的3种外源目的基因的多重PCR检测体系。利用已知样品对本体系验证,抗除草剂棉花LLCOTTON25能被同时检出SADI、P-Ca MV 35S、T-NOS、bar等4个基因,而其他样品均不能被同时检出这4个基因。结果表明此体系可运用于抗除草剂棉花LLCOTTON25检测。 相似文献
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利用多重PCR技术同时检测6种棉花转化体的方法研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】建立1种转基因棉花多重聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】试验选择6种转基因棉花作为多重PCR检测对象,通过引物终浓度配比和引物退火温度的两要素全组合优化多重PCR反应体系,并分析方法灵敏度。【结果】多重PCR较优的MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531引物终浓度为0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20μmol·L-1,较优引物退火温度为56℃,方法灵敏度为66个拷贝棉花基因组。利用盲样对上述体系的验证结果显示,所有盲样扩增条带与其含有的转基因转化体完全一致。【结论】本研究建立的体系可用于6种棉花转化体的快速检测。 相似文献
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Kazuyuki?Mori Yu?Sakamoto Nobuhiro?Mukojima Seiji?Tamiya Takashi?Nakao Takashige?Ishii Kazuyoshi?Hosaka
Multiplex PCR is practically a reasonable choice for molecular marker-assisted selection in potato breeding. We had developed
and were using a multiplex PCR method for selection of resistance genes to cyst nematode (H1), Potato virus X (Rx1) and late blight (R1 and R2). Since then, more reliable and tightly linked markers for H1 and R2, and a new marker for resistance to Potato virus Y (Ry
chc
) were developed. In this article, all these superior markers, including a positive marker to eliminate PCR-failed samples,
were incorporated into one multiplex PCR assay. Using the newly developed multiplex PCR technique, five plants potentially
harboring all five resistance genes were selected from 96 hybrid plants approximately 5 h after DNA extraction, which is a
third of the operation time compared with separate PCR reactions for each marker. 相似文献
17.
小麦优质谷蛋白亚基分子标记多重PCR体系的建立与应用 总被引：4，自引：0，他引：4
Ax1/Ax2*、Dx5和过量表达的Bx7亚基(Bx7OE)被认为是对小麦品质有正向效应的优质亚基。根据以上亚基特异性分子标记建立相应的多重PCR体系,经品种和群体检验,证明利用该体系鉴定亚基的结果稳定可靠、成本较低。利用该多重PCR技术对89份西藏小麦育成和推广品种(系)的优质亚基频率进行鉴定,结果表明, Dx5和Ax1/Ax2*亚基的频率均为12.4%,没有检测到Bx7OE,同时携带两个优质亚基的材料频率为10.1%,该麦区品质育种必须加强优质亚基的引入。针对优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5和Bx7OE的多重PCR体系,为小麦品质育种亲本评价和通过杂交方法聚合优质亚基基因提供了一种实用可靠的标记辅助选择技术。 相似文献
18.
番茄转录因子LeMADS-MC正反义植物表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
为进一步阐明转录因子家族MADS-Box对番茄果实成熟的调控途径,本研究利用聚合酶链式反应技术(PCR)从番茄(Solanum lycopersicum)cDNA中克隆LeMADS-MC基因和LeMADS-antiMC基因核心片段,将这2个基因通过酶切分别正向连接到pCAMBIA1300-221载体和反向连接到pCXSN载体中,并用冻融法将重组载体导入农杆菌中。获得的重组载体分别通过PCR及酶切鉴定符合预期结果且测序结果与NCBI同源性高达100%。结果成功构建了适合于番茄农杆菌遗传转化的植物表达载体,为下一步通过LeMADS-MC基因研究果实成熟衰老机理奠定了物质基础。 相似文献
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根据已发表的大肠杆菌毒素基因序列,针对大肠杆菌的8种毒素基因设计特异引物并进行多元PCR扩增,验证多元PCR技术的可靠性及其在水环境中大肠杆菌毒素基因检测的实用性。 相似文献
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中国竹类植物资源丰富,栽培历史悠久,是集生态、经济和社会价值于一身的园林植物。本研究以小琴丝竹和凤尾竹为材料提取叶片总DNA,通过PCR扩增技术克隆得到2种竹类植物LEA3基因,其中小琴丝竹LEA3基因全长810 bp,编码区序列编码188个氨基酸,GC含量为67.9%;凤尾竹LEA3基因全长分别为810 bp和834 bp,编码区序列分别编码188个氨基酸和195个氨基酸,GC含量为67.72%和68.53%。通过DNAMAN等生物软件分析发现,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因与其他禾本科LEA3基因同源性均在77%以上,同源性较高,且编码蛋白均属于稳定的亲水蛋白;此外,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因均包含一个完整的开放阅读框,其编码的氨基酸均含有6个由11个氨基酸组成的保守基元序列,本研究不仅为分析其他竹类植物的脱水耐受性机制提供基础数据,同时也为竹类植物及其他农作物抗旱育种提供了科学依据。 相似文献