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hTERT永生化山羊子宫内膜基质细胞系的建立及其致瘤性 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2014,(12):1976-1981
为了检测转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)后建立的山羊永生化子宫内膜基质细胞(endometrium stromal cells,ESCs)是否存在潜在致瘤性。将hTERT导入2代山羊ESCs中建立永生化山羊ESCs(hTERT-ESCs),利用免疫细胞化学方法鉴定细胞并检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达;分别取2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs,使用含不同浓度血清的培养液培养,利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测hTERT-ESCs在半固体培养基中的克隆形成能力,同时测定hTERT-ESCs的生长曲线。结果显示:转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈长梭形和三角形,与原代细胞形态一致,波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性;免疫细胞化学方法显示hTERT阳性;hTERT-ESCs在含不同血清培养基中生长速度不同,具有血清依赖性;软琼脂克隆试验显示2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs均不能在软琼脂中生长;hTERTESCs具有正常体细胞生长曲线。证明hTERT-ESCs基本保持了正常山羊ESCs的生物学特性,不具有致瘤性。 相似文献
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山羊子宫内膜上皮细胞转染pCI-neo-hTERT质粒后的永生化 总被引：2，自引：1，他引：1
为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),本试验将含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达质粒pCI-neo-hT ERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状,与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol/L的雌二醇(E2)可促进该细胞的增殖;50,100nmol/L的孕酮(P4)可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。 相似文献
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为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）,本试验将含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒pCI—neo—hTERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状。与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol／L的雌二醇（E2）可促进该细胞的增殖;50,100nmol／L的孕酮（P4）可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。 相似文献
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人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
利用包含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响。试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞。这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力。 相似文献
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利用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响.试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞.这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力. 相似文献
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《中国畜牧杂志》2021,(10)
本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并进行单克隆细胞株筛选。结果表明,所得EECs和ESCs分别具有上皮和基质细胞典型特征(上皮细胞呈铺路石状,基质细胞呈梭形)并表达特异性标记蛋白细胞角蛋白(Cytokeratin)和波形蛋白(Vimentin);EECs传至约50代,ESCs传至约30代后,光学形态观察、SV40T基因表达、标记蛋白免疫荧光及血清依赖性检测结果表明两类细胞形态未发生变化,均表达SV40T基因,并具有上皮细胞特性和基质细胞特性,伴有较强的血清依赖性,证实成功建立了EECs和ESCs细胞株;生长曲线和SV40T基因拷贝数检测结果显示ESCs的增殖能力要强于EECs,MOI 1:10和MOI 1:50感染下,SV40T基因拷贝数差异不显著。以上结果提示,SV40T基因能够大大增强绵羊EECs和ESCs体外增殖能力并延长其寿命,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究提供了素材。 相似文献
7.
本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。 相似文献
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为探讨不同雌激素（E2）和孕激素（P4）水平对家兔子宫内膜细胞体外增殖和分化的影响。采用离心法获取家兔子宫内膜上皮细胞及基质细胞，设不同雌激素和孕激素水平组合添加于培养液，利用MTT法间接测定不同性腺激素水平对子宫上皮和基质细胞的体外增殖的影响；利用免疫组织化学法检测传代细胞是否分化为其他类型细胞。结果表明利用离心法可获得纯度较高的子宫内膜上皮和基质细胞；孕激素（100nmol／L）对基质细胞的增殖有促进作用（P〈0.05），雌激素（100nmol／L）和少量孕激素（10nmol／L）对上皮细胞增殖有促进作用（P〈0.05）；免疫组化结果表明，经性腺激素刺激的子宫内膜上皮和基质细胞分别对上皮角蛋白抗体和波形蛋白抗体呈阳性。研究证实适宜的性腺激素水平对体外培养的子宫内膜细胞有促进增殖的作用，而且不会促使其分化为其他类型细胞。 相似文献
10.
将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。 相似文献