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1.
[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。 相似文献
2.
[目的]本试验旨在研究自噬对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响。[方法]以不同质量浓度DON(0,125,250,500,1 000和2 000 ng·mL~(-1))处理对数生长期仔猪海马神经细胞24 h后,采用倒置显微镜、透射电镜观察DON对仔猪海马神经细胞形态和超微结构的影响;采用p EGFP-LC3质粒瞬时转染细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的分布情况;采用Western blot检测DON对仔猪海马神经细胞自噬标志性蛋白LC3的表达;通过添加自噬激活剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂氯喹(CQ)来升高和降低细胞的自噬水平,CCK-8法检测细胞的存活率。[结果]不同质量浓度的DON均可诱导细胞自噬,自噬水平随着DON浓度的增加先上升后下降,在1 000 ng·mL~(-1)时达到峰值。与对照组相比,DON可显著抑制细胞存活率并诱导细胞发生明显的形态学变化,并呈剂量依赖性;随着DON浓度的升高,细胞LC3-Ⅱ含量先上升后下降,1 000 ng·mL~(-1)时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。与DON处理组相比,自噬水平的上升显著提高细胞活性(P0.05),而自噬水平的下降显著降低细胞活性(P0.05)。[结论]DON可以引起仔猪海马神经细胞自噬水平的上升,激活的自噬对DON导致的细胞损伤具有一定的保护作用。 相似文献
3.
[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
4.
[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。 相似文献
5.
利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。 相似文献
6.
《湖北农业科学》2015,(20)
自噬是细胞为维持自身代谢发生的胞质组分降解的动态过程。自噬不仅是细胞在饥饿环境下的一种适应性反应,而且对于组织和细胞维持动态平衡十分重要。细胞自噬出现问题往往会导致多种疾病。自噬相关基因被命名为Atg(Autophagy-related gene),LC3(Microtubule-associated protein 1 light chain3)是哺乳动物中了解的最透彻的一个Atg同源蛋白。LC3蛋白在细胞中存在两种剪切形式,即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,定位于自噬体膜的LC3-Ⅱ是自噬的标志性分子。详细论述自噬过程和LC3在自噬过程中的表达修饰过程,并进一步讨论自噬在神经退行性疾病和微生物感染中的生物学功能。 相似文献
7.
《南京农业大学学报》2016,(5)
[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L~(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力。[结果]氧化应激12 h后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率显著上升。在氧化应激前6 h LC3-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加;转染GFP-LC3质粒后,自噬体数量极显著上调,6 h后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4 h用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12 h,抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升。[结论]氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡和早期自噬,若抑制早期自噬,凋亡率会下降。 相似文献
8.
[目的]探索多角体病毒的包装特性,构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表达系统。[方法]通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为标记的绿色荧光基因EGFP,Bm CPV自身的多角体蛋白基因,用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽,插入到质粒Fast Bac Dual中,利用Ac MNPV Bac-to-Bac系统,得到整合表达重组Bacmid:Ac-polyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后,检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)和能在胞质形成多角体的重组病毒v Bm Bac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达;从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法,同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。 相似文献
9.
10.
[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础. 相似文献
11.
目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础. 相似文献
12.
目的 研究电离辐射对CNE-2细胞自噬活性和EPG5表达的影响.方法 CNE-2细胞用不同剂量电离辐射照射后,透射电镜、qRT-PCR、Western blot分别检测自噬形态、自噬标志物(P62、LC3)及EPG5表达;用RNA干扰技术(siRNA)沉默EPG5基因表达,qRT-PCR及Western blot检测自噬标志物及EPG5表达.结果 电离辐射引起自噬小体数量增加、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高(P＜0.01)、p62蛋白表达增加、EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01).EPG5-siRNA转染后EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01),P62、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P＜0.01).结论 电离辐射可能通过下调EPG5基因表达,阻滞自噬溶酶体形成,从而影响CNE-2细胞自噬水平. 相似文献
13.
【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对PC12细胞自噬的影响。【方法】以不同质量浓度(0(CK),125,250,500,1 000和2 000ng/mL)的DON处理PC12细胞24h后,采用倒置显微镜、透射电镜、免疫荧光、荧光定量PCR、Western-blot等技术,研究DON对PC12细胞形态和超微结构、LC3聚点率及自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62 mRNA和蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K表达的影响。【结果】不同质量浓度的DON均可诱导PC12细胞自噬,各试验组细胞自噬水平均高于对照组(CK),并随着DON质量浓度的增大而先增加后下降,在DON质量浓度为1 000ng/mL时达到峰值。与对照组相比,各试验组classⅢPI3 K mRNA和Beclin-1mRNA表达水平均极显著增高(P0.01),P62mRNA表达水平随着DON质量浓度的增加总体呈下降趋势,差异达显著(P0.05)或极显著(P0.01)水平。Western-blot结果显示,LC3Ⅱ蛋白表达量在DON质量浓度为1 000ng/mL时最高,与对照组相比,250~2 000ng/mL DON处理组的LC3Ⅱ蛋白表达量显著(P0.05)或极显著(P0.01)增加;500~2 000ng/mL DON处理组classⅢPI3K蛋白表达量较对照组显著(P0.05)或极显著(P0.01)增加,其中以1 000ng/mL DON处理组表达量最高;与对照组相比,不同质量浓度DON处理组P62蛋白表达量均极显著降低(P0.01),其中以1 000ng/mL DON处理组最低。【结论】DON能够诱导PC12细胞发生自噬,自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62及蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K等参与了DON诱导PC12细胞自噬的调控。 相似文献
14.
【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达. 相似文献
15.
pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。 相似文献
16.
[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P0.01)。凋亡相关基因Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平显著升高,P62和Atg7 mRNA等的表达也显著上调(P0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。 相似文献
17.
《南京农业大学学报》2017,(3)
[目的]以探讨参与脂滴代谢途径的一些基因缺失是否会影响细胞自噬为出发点,比较不同自噬检测方法所获得的试验结果的差异,用于优化自噬检测条件。[方法]首先用GFP标记自噬标志性蛋白Atg8以及mCherry标记脂滴蛋白Erg6并构建代表性自噬缺陷菌株,然后用普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜分别观察Atg8和Erg6的共定位情况。其次,利用生长表型检测和台盼蓝染色来检测磷脂基因相关突变体经氮饥饿处理后的细胞活性情况。最后,采用免疫印迹法检测磷脂合成突变体菌株cds1-DAmp经饥饿处理不同时间后细胞中GFP-Atg8的降解和prApe1的成熟情况。[结果]在营养丰富以及饥饿条件下,用普通荧光显微镜拍摄所统计出的m Cherry-Erg6与GFP-Atg8定位重叠结果高于用激光共聚焦拍摄所统计出的结果。长时间氮饥饿条件下,用生长表型检测和台盼蓝染色均能检测到与脂滴形态相关基因CHO1、MRPS35、CDS1缺失会显著影响细胞的存活率;但用生长表型检测发现CAX4缺失菌株存活显著低于野生型时,用台盼蓝染色检测发现CAX4缺失细胞存活率却与野生型无显著性差异。用免疫印迹法检测CDS1缺失菌株中自噬缺陷时,通过检测GFP-Atg8的降解,氮饥饿大于4 h时的CDS1缺失菌株中GFP-Atg8的降解能力显著低于野生型,但通过检测prApe1的成熟,CDS1缺失菌株中prApe1的成熟缺陷在各个时间段均可检测到。[结论]验证了酵母脂滴代谢途径中以CDS1为代表的相关基因参与了细胞自噬。不同的检测条件、方法等因素对检测结果产生较大影响,甚至会出现相反结论,建议在酿酒酵母中进行类似的自噬检测时需要同时结合多种试验方法与手段来获取数据,以便用于结论与分析。 相似文献
18.
[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。 相似文献
19.
FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。 相似文献
20.
《南京农业大学学报》2020,(1)
[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P0.01)。内质网应激相关基因CHOP和GRP78 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性上调(P0.01),自噬相关基因Atg7 mRNA表达呈浓度依赖性增加(P0.01),p62 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性减少(P0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。 相似文献