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1.
一氧化氮对NaCl胁迫下苜蓿种子萌发的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
以甘农4号、阿尔冈金2个品种苜蓿为材料,用一氧化氮(NO)供体硝普钠、NO 清除剂c-PTIO、一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲脂、硝酸还原酶抑制剂钨酸钾及硝普钠类似物亚铁氰化钠(不产生NO)处理苜蓿种子,研究NO对盐胁迫下苜蓿种子萌发的生理效应。结果表明,盐胁迫显著抑制了2个苜蓿品种的发芽率、胚芽和胚根长及幼苗干重(P<0.05),降低种子萌发过程中α、β-淀粉酶、蛋白水解酶活性,抑制淀粉水解和可溶性糖积累(P<0.05);盐胁迫下添加外源NO则使2个品种苜蓿α、β-淀粉酶、蛋白水解酶活性、种子发芽率显著提高(P<0.05),淀粉含量降低,可溶性糖含量升高、胚芽和胚根长及幼苗干重显著增加(P<0.05);NO 供体SNP 的类似物亚铁氰化钠对盐胁迫下苜蓿种子萌发的各项指标无明显影响;施用NO 清除剂c-PTIO、硝酸还原酶抑制剂钨酸钾和一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲脂具有降低苜蓿种子萌发的效应(P<0.05)。因此,盐胁迫抑制苜蓿种子的萌发,而添加外源NO是缓解这种抑制作用的有效途径,内源NO也可能参与盐胁迫下苜蓿种子萌发的调节,且通过NOS和NR途径产生的NO在缓解盐胁迫抑制苜蓿种子萌发中可能起关键作用。 相似文献
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《核农学报》2012,26(4)
以甘农4号、阿尔冈金2个品种苜蓿为材料,用一氧化氮（NO）供体硝普钠、NO清除剂c-PTIO、一氧化氮合酶抑制剂N-硝基．L-精氨酸甲脂、硝酸还原酶抑制荆钨酸钾及硝普钠类似物亚铁氰化钠（不产生NO）处理苜蓿种子,研究NO对盐胁迫下苜蓿种子萌发的生理效应。结果表明,盐胁迫显著抑制了2个苜蓿品种的发芽率、胚芽和胚根长及幼苗干重（P〈0．05）,降低种子萌发过程中α、β-淀粉酶、蛋白水解酶活性,抑制淀粉水解和可溶性糖积累（P〈0．05）;盐胁迫下添加外源NO则使2个品种苜蓿α、β淀粉酶、蛋白水解酶活性、种子发芽率显著提高（P〈0．05）,淀粉含量降低,可溶性糖含量升高、胚芽和胚根长及幼苗干重显著增加（P〈0．05）;NO供体SNP的类似物亚铁氰化钠对盐胁迫下苜蓿种子萌发的各项指标无明显影响;施用NO清除剂c-PTIO、硝酸还原酶抑制剂钨酸钾和一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲脂具有降低苜蓿种子萌发的效应（P〈0．05）。因此,盐胁迫抑制苜蓿种子的萌发,而添加外源NO是缓解这种抑制作用的有效途径,内源NO也可能参与盐胁迫下苜蓿种子萌发的调节,且通过NOS和NR途径产生的NO在缓解盐胁迫抑制苜蓿种子萌发中可能起关键作用。 相似文献
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本研究中用融合标签技术通过单质粒转化和双质粒转化分别促进Aβ1-42淀粉样蛋白的可溶性表达。构建重组载体pET（yd-b42）、pET（Msb-b42）、pET（Od-b42）、pAY-sls[ydb42]、pAY-sls[tydb42],并在大肠杆菌中表达,通过SDS-PAGE验证分析。标签yd、Msb、Od、tyd都能很好的促进Aβ1-42淀粉样蛋白可溶性表达,其中yd、tyd的促溶效果最好。Aβ1-42淀粉样蛋白能在大肠杆菌中可溶性表达。为阿尔茨海默病的治疗提供进一步理论基础。 相似文献
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茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达 总被引：9，自引：0，他引：9
摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(Camellia sinensis ) β-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表达。结果表明，该酶cDNA全长序列为1 475 bp(GenBank登录号为AF537127)，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63 kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。 相似文献
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肝细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)调控众多的肝脏特异性基因,参与机体的脂类、糖类和蛋白质的代谢过程。以PCR技术从本研究室已构建的真核表达载体pc DNA3.1-HNF1α质粒上扩增获得鸡(Gallus gallus)HNF1α的编码序列,在其5′、3′端分别引入的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,以此位点将其克隆入p ET30a表达载体,并构建获得重组表达菌BL21-p ET30a-HNF1α。然后以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)(0.1~0.8 mmol/L)优化重组蛋白的诱导表达,并采用15℃的低温诱导重组蛋白的可溶性表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析结果显示,与未诱导组相比,重组表达菌在37℃下,经不同浓度的IPTG诱导4 h后均能产生一条约69 k D的蛋白条带,与预计目的蛋白HNF1α的大小相一致,且IPTG浓度在0.1 mmol/L时诱导重组蛋白的量高于其他浓度组,而低温诱导未能使重组蛋白可溶性表达。于是采用8 mol/L尿素变性包涵体,溶解重组蛋白,通过融合在HNF1α重组蛋白C端的6-His多肽,以Ni2+对重组蛋白进行亲和层析纯化,结合固—液两相法对目的蛋白进行原位复性。结果显示通过Ni2+亲和层析和目的蛋白原位复性相结合的一步纯化法,成功地从包涵体中获得了纯度高达95%以上的重组蛋白HNF1α,这为研究鸡HNF1α在糖脂代谢、机体生长及抗体的制备等方面提供了物质保障。 相似文献
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bar因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的分离和纯化 总被引：1，自引：1，他引：1
bar基因来源于P3301质粒载体,通过构建PB813测序载体对bar基因进行了测序,与GenBank中bar基因全编码区比较发现：在DNA上有两个碱基不同,但在蛋白质水平上完全相同。用PCR方法从P3301载体上克隆了552碱基的bar基因全长序列插入到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET30a( )中,构建了pET30a-bar融合表达载体并转人大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-bar融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),并通过金属鏊和层析一步纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了PAT纯品。 相似文献
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本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。 相似文献
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豇豆胰蛋白酶抑制剂和硫氧还蛋白的融合表达和活性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
采用融合蛋白表达技术，通过1个人工设计合成的柔性接头，将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因与表达载体上的硫氧还蛋白(thioredoxin )基因连接，构建了融合表达载体。将表达载体转入大肠杆菌(Escherichia coli )GI724，通过色氨酸诱导获得高效表达，产物以可溶状态存在。活性测定显示，融合蛋白具有抑制胰蛋白酶的生物学活性。以大豆胰蛋白酶抑制剂为参照，将融合蛋白热处理后进行活性测定，发现它具有较好的热稳定性。将肠激酶(enterokinase)与融合蛋白在37 ℃作用16 h，可获得切掉thioredoxin的CpTI蛋白。活性测定显示，切除thioredoxin后CpTI的胰蛋白酶抑制活性比同样处理条件下的thioredoxin-CpTI明显下降，比活力仅为原来的80%，说明融合蛋白具有更高的稳定性。研究结果为thioredoxin-CpTI作为一种生物农药的应用奠定了基础。 相似文献
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许文涛 《农业生物技术学报》2008,16(4)
本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。 相似文献
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营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为Vip1、Vip2和Vip3三种,以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性,具有重要研究意义。本研究以Bt WB5菌株总DNA为模板,采用PCR方法扩增vip3Aa(Gen Bank登录号:AAM22456)全长,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体p Czn1连接,构建重组表达载体p Czn1-vip3Aa,转入大肠杆菌Arctic ExpressTM(DE3),异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在沉淀和上清中均有约88 k D VIP3Aa蛋白质表达产物;采用Ni亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化,获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因,并表达纯化了VIP3Aa蛋白,为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。 相似文献
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本研究将CCK33基因四串体片段克隆到原核表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-4CCK33。将其转化大肠杆菌BL21中表达,经SDS-PAGE可检测到分子量约为53 kDa的融合蛋白,最高表达量占菌体总蛋白的30.08%,蛋白可溶性分析表明,融合蛋白主要是以可溶性形式表达。Western-blotting证实,可溶表达的融合蛋白与CCK-8阳性血清具有良好的免疫反应性。将纯化的可溶性融合蛋白制成油乳剂疫苗,主动免疫蛋鸡,ELISA检测结果表明,该融合蛋白能在鸡体内引起免疫。用含CCK抗体的蛋黄粉饲喂82天龄肉猪,试验结果表明,在肉猪饲料中添加100g/t含CCK抗体蛋黄粉,试验期间平均日增重和采食量与阴性蛋黄粉组相比,分别提高6.64%和8%,差异显著（P<0.05）。 相似文献
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为了探索酸雨胁迫对大豆萌发种子糖代谢动态的影响,试验采用蒸馏水浸泡大豆种子,再以pH2.5、4.5模拟酸雨(AR)处理大豆种子,考察不同强度AR胁迫对大豆萌发种子可溶性糖、还原性糖、蔗糖、淀粉及α、β-淀粉酶含量的影响。结果表明,第1天AR组的可溶性糖含量上升,第2天明显降低,随后稳定降低;AR胁迫下的第1天-第4天,还原糖含量维持较高水平,第3天-第5天呈下降趋势;pH2.5组在第2天-第5天蔗糖含量减少;AR胁迫的第2天-第4天淀粉含量降低;总体上,AR组的α-淀粉酶活性CK,但从第5天起pH2.5组的α-淀粉酶活性CK;β-淀粉酶活性在第1天-第6天高于或接近CK,pH2.5组在第7天低于CK。糖代谢各项指标和淀粉酶活性之间的关系表明,可溶性糖、还原糖、蔗糖含量变化幅度随AR胁迫强度增大而增加,淀粉含量变化与之相反;AR组对淀粉酶活性影响是导致萌发改变的内在因素之一。 相似文献
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为了进一步研究磷脂酶C的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了Ds PLC的开放阅读框序列,并与质粒p GS21a连接,构建了原核表达载体p GS21a-Ds PLC。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达出融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在包涵体和上清中均存在。可溶性蛋白经His柱纯化后进行电泳分析,结果表明,在96k Da左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在96kDa左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白是带有His标签的磷脂酶C。盐藻磷脂酶C的成功表达与纯化,为深入探讨磷脂酶C的性质及功能奠定了基础。 相似文献
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将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)缺失C端154个氨基酸编码区的vip3A基因(vip3T)插入原核表达载体pQE30，构建了重组表达载体pQEvip3T，并转化大肠杆菌(Escherichia coli ) M15进行IPTG诱导表达，比较了完整的Vip3A蛋白和C端缺失的蛋白Vip3T的可溶性和杀虫活性。与Vip3A不同，融合蛋白Vip3T以不可溶的包含体形式存在，诱导表达的菌液中没有检测到可溶性Vip3T蛋白。生物测定结果表明，M15(pOTP)诱导表达的Vip3A蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litua)和甜菜夜蛾(S. exigua)幼虫具有较高的杀虫活性，其提纯的包含体无毒，但包含体的碱性裂解液却又恢复了对夜蛾科害虫的活性；M15(pQEvip3T)菌液、包含体及其碱性裂解液对这两种昆虫幼虫则完全无毒，说明在大肠杆菌中，Vip3A蛋白C端氨基酸可能对Vip3A蛋白的可溶性和杀虫活性具有重要的影响。 相似文献
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马铃薯是淀粉生产中重要的农作物之一,而可溶性淀粉合成酶SSⅢ是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分,通过基因工程的手段来研究SSⅢ基因在淀粉合成中的功能可以用于改良马铃薯淀粉的品质。本研究采用根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV35S驱动的可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的RNA干扰表达载体导入马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得了65株卡那霉素抗性植株。对抗性植株PCR检测结果表明,SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中,RT-PCR检测表明SSⅢ基因在转录水平上受到了明显抑制。该研究为马铃薯淀粉品质的改良奠定了基础。 相似文献
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旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与胚柄特异基因G564启动子顺式元件结合的转录因子。本研究根据植物胚柄特异表达基因G564启动子关键序列(GAAAAGCGAA)合成了5次串联重复序列,并与报告质粒pHIS2.1连接构建诱饵载体pHIS2.1-G564-5A;以纯化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼嫩种子mRNA为模板,合成SMARTTMⅢ和CDSⅢ锚定末端dscDNA;并将dscDNA与线性化融合表达载体pGADT7-Rec2以及诱饵载体pHIS2.1-G564-5A共转化到酵母Y187,构建酵母单杂交文库。文库的共转化效率为5.53×105cfu/μg。对文库中的阳性克隆进行测序,获得117条可读序列。对其进行基因功能注释并进一步分析基因的功能发现,具有DNA结合功能的蛋白14个,具有蛋白质结合功能的蛋白8个。上述22个蛋白包括TATA结合蛋白1(TBP1),支架结构相关区(SAR)DNA-结合蛋白,胚珠发育蛋白,G-box结合因子1(GBF1),组蛋白H3等。本研究为分离和克隆胚柄中特异表达的转录因子提供了候选基因。 相似文献
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本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究. 相似文献