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1.
为分析牛瑟氏泰勒虫延边株18SrRNA基因序列,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫18SrRNA基因序列设计2对特异性引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pMD18一T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,对测序结果用DNAMAN软件时其与GenBmlk上8个虫株相关序列进行同源性比较,建立系统发育树。结果显示,牛瑟氏泰勒虫中国延边株的18SrRNA基因大小为1744bp,瑟氏泰勒虫延边株、兰州株、日本株以及水牛泰勒虫中国株彼此之间亲缘关系最近;瑟氏泰勒虫延边株与突变泰勒虫亲缘关系较远： 相似文献
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为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达． 相似文献
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[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]为研制牛瑟氏泰勒虫病基因工程苗和诊断试剂盒提供依据。[方法]通过PCR方法从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中克隆了1个P23基因,连接到pGEM-T-Easy载体中。运用生物信息学方法对该基因进行分析。[结果]P23基因全长为684 bp,包含1个长672 bp的开放阅读框,编码223个氨基酸,相对分子量是25.886 kD,等电点pI为9.22,包括1段19个氨基酸组成的信号肽和2段跨膜区。该序列在GenBank上的注册号为EU573168,与瑟氏泰勒虫Chitose型(D84446)和Ikeda型(D84447)的同源性分别为99%、90%。[结论]P23基因编码的蛋白有较好稳定性和免疫原性,可作为制备牛瑟氏泰勒虫基因疫苗的候补抗原。 相似文献
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【目的】实现对绒山羊环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的鉴别诊断。【方法】研究在形态学鉴定的基础上,结合分子生物学方法,分别根据二者的差异保守基因30KDa基因和MPSP表面蛋白基因设计上下游引物进行片段扩增和序列鉴定。【结果】制作的血涂片经显微镜观察,在红细胞内一侧边缘可见一个或多个,环形,杆状,梨籽形等多形态的虫体,经姬姆萨染色后,虫体原生质呈淡蓝色,染色质呈红色。以发生泰勒虫病绒山羊的血液DNA为模板,进行PCR扩增,分别在193 bp和875 bp处获取目的条带。测序数据和GenBank登录的环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫同源性为100%。此外,通过敏感性试验发现,实验所建立的PCR检测方法能够检测出环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的最低检测量分别为0.15 fg和0.17 fg。 相似文献
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热激蛋白（ HSP）是生物适应环境温度变化的重要媒介分子,本试验中克隆了多子小瓜虫Ichthyoph-thirius multifiliis HSP70（Im HSP70）基因的ORF,采用荧光定量RT-PCR法,在水温为20、25、30℃的条件下检测了HSP70基因在多子小瓜虫幼虫、滋养体和包囊3个不同发育阶段的表达情况。结果表明：Im HSP70基因的ORF为1995 bp,预测编码为664 aa; Im HSP70蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主,空间构型包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域;与其他物种HSP70蛋白序列进行同源性比较发现, Im HSP70与螅状独缩虫Carchesium polypinum HSP70的同源性最高,为78.08%; Im HSP70与分类地位同为纤毛门的螅状独缩虫、嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila、变藓棘毛虫Sterkiella histriomuscorum的HSP70聚在一个分支;3种温度下幼虫的HSP70表达量均最低,20℃和25℃时, HSP70基因在滋养体中的表达量显著高于幼虫和包囊（P〈0.05）,而30℃时, HSP70基因在包囊中的表达量显著高于滋养体和幼虫（P〈0.05）;30℃时HSP70基因在包囊中的表达量显著高于25℃（P〈0.05）。研究表明,试验所用多子小瓜虫的HSP70基因在30℃时仍大量表达,且能感染试验鱼,推测该虫株为热带型多子小瓜虫, HSP70基因在多子小瓜虫对抗外界高温环境中可能发挥着重要的作用。 相似文献
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[目的]为更好地研究HSP70热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用PCR方法克隆了水稻花药特异表达启动子Osg6B,将其与设计合成的HSP70反义片段连接,构建了由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HSP70反义表达载体,并进行了PCR和酶切鉴定。[结果]克隆的Osg6B启动子序列与所发表的序列同源性高达97%,启动子区域的顺式调控元件完整;构建的由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HPS70反义表达载体通过了菌落PCR验证和表达载体值粒的酶切鉴定,载体构建成功。[结论]该表达载体的构建将为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。 相似文献
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[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达.[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆人pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆人表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌.通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性.[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008～1.000 mmol/L的IPTC对表达量的影响不大.Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性.[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础.
Abstract：
[Objective] The aim was to study cloning and prokaryotic expression of P23 major surface protein gene of Theileria sergenti.[Method]A pair of specific primers was designed according to the sequence of P23 major surface protein of T.sergenti (D84447).The P23 gene was amplified by PCR from genomic DNA of T.sergenti and cloned into pMD18-T vector to construct recombinant clonal vector pMD18-P23.Positive clones were identified by PCR screening and restriction digestion.A recombinant expression plasmid pGEX-4T-P23 was constructed by subcloning the cloned P23 gene into the linearized pGEX-4T-1 vector and transformed into E.coil BL21.After introduction by IPTG,the expressed fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western-blotting. [Result] The cloned gene has a total length of 507 bp.Sequencing result showed that the nucleotide sequence of the cloned P23 gene shared 99.4% identity with that of P23 published in GenBank (D64447).The expressed fusion protein was 46 ku in molecular mass.Induction opportunity of zhours after culture inoculation was the best,the induction time of 6 h was the best,and induction temperature of 34 ℃ was the best as well,IPTG of 1 mmol/L had little effect on the expression.Western-blotting indicated that recombinant protein was recognized by specific antibody. [Conclusion] This study would lay a foundation for further research on the prevention and diagnose of T,sergenti. 相似文献
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对牛双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)潜在药物靶标Rap-1的基因进行克隆与序列分析.以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板,经PCR扩增获得了rap -1基因,将该基因克隆到pGEM-T Easy Vector上,对重组质粒进行PCR扩增,对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析.结果表明,rap -1基因长度为846 bp,同源性分析结果显示,克隆序列与GenBank收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为99.74％,说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的rap-1与GenBank公布的参考基因具有高度同源性,rap-1基因具有很高的保守性. 相似文献
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牛瑟氏泰勒虫P23基因的克隆与生物信息学分析(英文) 总被引：3，自引：0，他引：3
[Objective] The aim of this study is to provide basis for developing genetic engineering vaccine and diagnostic kit for Theileria sergenti infection. [Objective] P23 gene of Theileria sergenti was amplified from its genomic DNA by PCR amplification, and cloned into the pGEM-Easy vector; then the sequencing result was analyzed with bioinformatics methods. [Result] Whole length of the P23 gene from Theileria sergenti is 684 bp containing a 672 bp open reading frame. The deduced amino acid sequence (223 amino acid residues) contains a signal peptide of 19 amino acid residues and two fragments of transmembrane domains, with relative molecular weight of the 25.886 kD and with the pI of 9.22. The homology between the yielded sequence and Chitose of Theileria sergenti P23 gene(TS-Chitose type, D84446), Ikeda of Theileria sergenti P23 gene(TS-Ikeda type, D84447) reached 99% and 90%, respectively. The sequence has been accessed in GenBank(EU573168). [Conclusion] The protein encoded by the P23 gene has better stability and immunogenicity, thus can be used as the antigen candidate for preparing genetic engineering vaccine for Theileria sergenti. 相似文献
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荷斯坦牛HSP70-1基因遗传多态性与乳腺炎抗性关系分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR-SSCP和PCR-RFLP相结合的方法检测HSP70-1基因在253头中国荷斯坦牛中的多态性,并分析其多态性与体细胞评分(SCS)的相关性.结果表明,HSP70-1基因扩增片断的1 623 bp处产生G-A的突变,1 623bp处产生G-A-C的突变.两位点都是沉默突变,未引起氨基酸序列的改变.HSP70-1基因分别经EcoRⅡ、BglⅠ、FokⅠ消化后表现多态性.经χ2 适合性检验,中国荷斯坦牛在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态.同时,群体基因座不同基因型与SCS相关分析的结果表明,2 409位点基因型与SCS相关性不显著,1623位点与SCS相关性显著,CC型SCS指标显著低于AG、GG型(P＜0.05),CC基因型可作为乳腺炎抗性的有利基因型,可将HSP70-1基因作为奶牛乳腺炎候选基因,将应用于分子标记辅助选择育种,为乳腺炎抗性牛群的选育奠定一定的理论基础. 相似文献
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[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析. 相似文献
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本文是一篇牛血孢子虫病疫源地特点,亦即流行过程特点的,调查报告文内对疫源地四要素,疫源地内牛只种别、品种、性别和年令的差别性以及本病的季节性和周期性作了详细的记述和分析。 1、不同种别、品种的牛只在血孢子虫带虫率方面也各不相同,奶牛与黄牛的带虫率之比无差异性(X~2=3.27、P>5％),而黄牛与水午以及奶牛与水牛带虫率之比则有明显的差异性,前者为X~2=131.5,P<1％,后者为X_2=145.51,P<1％。 2、血孢子虫的带虫率与水牛性别间的差异性表现得也各不相同,其中只有奶牛在性别问的差异性非常明显外(X_2=10.7,P>1％),黄牛和水牛性别向差异则不显著(前者X_2=0.6994,P>5％,后者X_2=0.0025,P>5％)。关于不同种血孢子虫的带虫率与牛只性别间的差异性,根据调查得知,奶止对双芽焦虫,瑟氏泰勒焦虫和突变泰勒焦虫的带虫率无明显的性别问差异,但对牛巴贝斯焦虫则有较明显的差异性,黄牛对双芽焦虫和瑟氏泰勒焦虫的带虫率具有明显的性别间差异,而对突变泰勒焦虫和牛巴贝斯焦虫则无性别间差异性。 3、奶牛血孢子虫病的发病与年令的关系,根据调查,以1岁的牛只发病者最多,发病率占47.6％,其后随着奶牛年令的增加而发病率逐渐降低。 4、血孢子虫病的发病季节,双芽焦虫主要发生于五月中旬至十一月下旬期间,在这期间出现两个高峰,第一个高峰出现于七月下旬,第二个高峰发生于九月下旬,四月份以前和十一月上旬以后只有极个别的发病,甚至不发病;牛巴贝斯焦虫病流行于七月上旬至十一月上旬,在七月下旬及九月下旬各出现一个高峰;柯契卡巴贝斯焦虫病发生在五月中旬至十一月上旬,但在十月中,下旬发病者最多;瑟氏泰勒焦虫病发生于六月中旬至十月上旬,在七月下旬及九月下旬各出现一次高峰;突变泰勒焦虫病发生于五月下旬至十一月上旬,在这期间一直保持其一定的流行强度,但也可以看出在七月下旬及十一月上旬各出现一次高峰。 5、讨论中根据文献中叙述的各地区牛血孢子虫病的流行季节性,提到按疫源地来认识该病的流行是有必要和可能的。 6、根据调查,血孢子虫病无明显的周期性,一般牛只在发生一次或两次血孢子虫病后,间隔1或两年再发生一次,病后就不再发病了,也有的在连续发病2—3次后就不再发病了,这可能与牛只在发病后具有一定的免疫力或具有年令免疫性所致。 相似文献