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【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。 相似文献
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【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/mL,操作相对简单。【结论】实时荧光PCR方法适合灵敏度要求高、且具备良好实验条件时使用;CPA恒温扩增法适于对灵敏度要求不高、实验室条件简单的基层实验室使用。 相似文献
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以单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等6种常见食源性致病菌为研究对象,优化试剂盒工艺参数,采用琼脂糖凝胶电泳及OD260/OD280分析基因组DNA提取效果。结果表明,试验试剂盒可在30 min内完成基因组DNA提取,对常见10类食品样品抗基质干扰能力强。与实时荧光PCR技术联用,检测染菌量1~10 cfu·25 g-1食品样品时,仅一次增菌可得阳性结果;市售食品样品检测与国标方法结果无显著差异。所研制病原菌基因组DNA提取试剂盒适用于食品病原菌快速检测。 相似文献
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单增李斯特菌是一种重要的人畜共患食源性致病菌,如何有效控制食品(尤其是即食食品)中的单增李斯特菌,是食品安全的重要任务,其中快速、准确的检测技术是关键因素之一.作者对单增李斯特菌的传统检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法进行综述,并对目前国内单增李斯特菌检测过程中所存在的问题进行探讨,以期为今后的研究提供参考. 相似文献
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【目的】了解陕西杨凌辖区生猪肉、生羊肉、生鸡肉、速冻饺子和即食食品等5类食品中单增李斯特菌的污染情况及其耐药性和血清型,为确保食品安全提供依据。【方法】随机采集杨陵2家超市及1家农贸市场的食品样本共计95个,其中包括生猪肉27份、生羊肉11份、生鸡肉38份、速冻饺子6份和即食食品13份,按照国标GB/T4789.30-2008进行单增李斯特菌的分离培养,用PCR方法进行单增李斯特菌的确证,并用多重PCR法对确证菌株进行血清型测定,采用琼脂稀释法进行药敏性试验。【结果】95个样本中,单增李斯特菌的分离率为13.7%(13/95),其中以即食食品分离率最高,为30.8%(4/13);其次是生鸡肉和生羊肉,分别为21.1%(8/38)和9.1%(1/11);而速冻饺子和生猪肉均未检出单增李斯特菌。超市采集样品中单增李斯特菌污染的检出率较高,为23.6%,农贸市场采集样品中未检出单增李斯特菌。不同温度贮存的样品中,4 ℃贮存样品单增李斯特菌污染的检出率最高,为31.6%,-18 ℃条件贮存样品的检出率为5.9%,而常温贮存样品中未检出单增李斯特菌。单增李斯特菌对头孢西丁、红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、四环素、氯霉素、头孢哌酮的耐药率分别为100%,11.1%,14.8%,26%,4%和3.7%,对庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星100%敏感。单增李斯特菌分属5个血清型群体,其中17(63.0%)株为1/2b或3b型,6株(22.2%)为1/2a或3a型,1株(3.7%)为1/2c或3c型,1株(3.7%)为4b、4d或4c型,2(7.4%)株为4a或4c型。【结论】陕西杨凌辖区即食食品和生鸡肉是主要污染单增李斯特菌的食品品种,该单增李斯特菌菌株存在一定程度的多重耐药现象,主要为1/2b或3b及1/2a或3a血清型,对消费者的健康有一定的潜在的危险。 相似文献
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《江苏农业学报》2014,(3)
为研究叠氮溴化丙锭(PMA)在单增李斯特氏菌检测中的作用,利用实时荧光PCR方法检测不同浓度PMA处理的单增李斯特氏菌标准菌株CMCC 54004的死菌和活菌核酸的扩增情况。结果显示,1.0 mg/ml PMA能有效抑制单增李斯特氏菌死菌核酸的扩增。经过PMA处理后单增李斯特氏菌死菌与未经PMA处理的检测结果间差异极显著,而PMA处理后CMCC 54004活菌与未经PMA处理的检测结果间差异性不显著。通过对PMA处理的CMCC 54004死菌、活菌、不同比例死菌与活菌混合液以及其在不同食品基质下的检测结果的比较,进一步证实,1.0 mg/ml PMA在单增李斯特氏菌检测中能有效减少死菌核酸的影响,提高检测结果的可靠性。 相似文献
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TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。 相似文献
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银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]了解银川市市售食品中单增李斯特菌的污染状况及其血清型和耐药性特点。[方法]以宁夏银川市售各类生鲜食品为原料,菌株的分离鉴定按照GB4789．30—2010《单核细胞增生李斯特氏菌检验》和国家食源性疾病监测网监测方案进行;血清型检验按照血清凝集试验进行;药物敏感性试验按照K—B纸片扩散法进行。[结果]720份食品中检出单增李斯特菌45株,总检出率为6．25％,分属5个血清型,主要为1／2a型。污染率最高的是生鸡肉（8．33％）。耐药性研究表明单增李斯特菌对多粘菌素的耐受最严重,耐药率为77．78％,此外还耐受头孢噻肟、四环素、呋喃妥因、青霉素、红霉素和头孢噻吩,且出现多重耐药。[结论]银川市食品中存在不同程度的单增李斯特菌污染,生肉中单增李斯特菌检出率较高,应加强监测工作。同时存在致病性较强的血清型,呈多重耐药性趋势。 相似文献
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传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义.本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR(multiplex PCR)条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法.通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明:该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增菌4～8 h其最低检出限可达1 cfu/mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域. 相似文献
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肉中两种致病菌的双重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PCR检测方法,以金黄色葡萄球菌nuc基因和单增李斯特菌hly基因为靶基因设计引物,通过优化退火温度和PCR反应体系,建立这两种菌的双重PCR检测方法,并分析其反应特异性和敏感性。进一步将该方法应用到人工模拟肉样中,并分析其敏感性。结果表明,建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法应用于人工模拟肉样中具有较高敏感性,其中金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌最低检测限分别为102和103 cfu.mL-1。该方法的建立为食品中多种致病菌的同时检测奠定了基础。 相似文献
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食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究 总被引：11，自引：0，他引：11
传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。 相似文献
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单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。 相似文献
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[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hly A、prf A、bsh、act A、sig B和inl A)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。 相似文献
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荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌 总被引：4，自引：1，他引：4
[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。 相似文献
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为了研究保定、石家庄及周边地区生肉来源的单增李斯特菌株彼此之间的亲缘关系,揭示不同来源、不同时间、不同地域的单增李斯特菌流行变化规律,为该病原菌的检测、防治以及溯源提供依据。对从生鲜肉分离出的129株食源性单增李斯特菌进行RAPD扩增,用NYSYS-PCversion 2.1分析软件采用不加权成对算数平均法(UPAMA)进行聚类分析。采用单一引物(RP1)对129株生肉来源的单增李斯特菌进行RAPD聚类分析,得到了129株单增李斯特菌的DNA指纹图谱,绘制出其亲缘关系的聚类树状图。结果表明:129株生肉来源的单增李斯特菌可分成6个基因聚类,其中第Ⅱ类为保定、石家庄地区的主要流行种群;对单增李斯特菌遗传多态性及其随时间、地域及其菌株来源的变化进行分析,表明该地区生肉来源的单增李斯特菌由于取样时间、地点不同,其基因聚类差异明显,相同时间、相同地点的单增李斯特菌株之间亲缘关系较近。本研究表明四种生肉来源的单增李斯特菌具有广泛的遗传多态性;单增李斯特菌的流行具有明显的时间性、地域性。 相似文献
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三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义. 相似文献