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番木瓜幼叶原生质体分离研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】探讨番木瓜幼叶原生质体的最佳分离条件。【方法】以20～30日龄番木瓜无菌苗幼叶为材料,对原生质体分离过程中酶液组合、酶解时间、纯化离心速度（500～1500 rpm）及离心时间（6～10 min）进行探讨。【结果】随着酶解液中纤维素酶和果胶酶含量的提高,番木瓜原生质体产量逐渐升高,而其活力逐渐降低,其中以为2.0%纤维素酶+ 0.5%果胶酶组合的效果较好,解离时间以8 h为宜。随着酶解液中甘露醇浓度的升高,原生质体的产量呈现先增加后降低的趋势,在0.55 mol/L时达到最大（2.48×106个/gFW）。在悬浮纯化原生质体时,以1000 rpm离心6～8 min的效果较好。【结论】适宜原生质体分离的酶解液为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+25 mmol/L MES+0.55 mol/L甘露醇,最适酶解时间为8 h;在原生质体纯化时,使用1000 rpm离心6~8 min,有利于获得产量及活力较高的原生质体。 相似文献
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番木瓜幼叶原生质体分离研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】探讨番木瓜幼叶原生质体的最佳分离条件。【方法】以20～30日龄番木瓜无菌苗幼叶为材料,对原生质体分离过程中酶液组合、酶解时间、纯化离心速度（500～1500rpm）及离心时间（6～10min）进行探讨。【结果】随着酶解液中纤维素酶和果胶酶含量的提高,番木瓜原生质体产量逐渐升高,而其活力逐渐降低,其中以为2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶组合的效果较好,解离时间以8h为宜。随着酶解液中甘露醇浓度的升高,原生质体的产量呈现先增加后降低的趋势,在0.55mol/L时达到最大（2.48×106个/gFW）。在悬浮纯化原生质体时,以1000rpm离心6～8min的效果较好。【结论】适宜原生质体分离的酶解液为2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋25mmol/LMES＋0.55mol/L甘露醇,最适酶解时间为8h;在原生质体纯化时,使用1000rpm离心6~8min,有利于获得产量及活力较高的原生质体。 相似文献
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毛葡萄原生质体分离与纯化研究 总被引：4，自引：0，他引：4
以毛萄萄愈伤组织、悬浮培养细胞,无菌苗幼叶为材料,研究了毛葡萄原生质体的分离纯化方法及影响因素.结果表明,毛葡萄原生质体分离材料以悬浮细胞和愈伤组织最好.毛葡萄愈伤组织在0.5 mol/L甘露醇中预处理90 min,CPW+13%甘露醇+2%纤维素酶+0.25%果胶酶+0.5%离析酶的酶液中酶解10 h,其原生质体产量最高可达6.24×106个/g,活力为86.83%. 相似文献
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花椒原生质体分离与培养研究 总被引：2，自引：0，他引：2
以花椒试管苗叶片、愈伤组织和悬浮细胞为试验材料,通过单因素试验研究酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离的影响,并以花椒试管苗叶片分离出的原生质体为试验材料,研究培养基种类、培养密度、不同激素配比对花椒原生质体培养的影响。结果表明,酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离有显著影响。在适宜条件下,用甘露醇作花椒原生质体分离的渗透压调节剂,浓度在0.6~0.7 mol·L-1时分离效果最佳。以花椒叶片为原生质体分离材料的最佳酶液组成为CPW-0.7 mol·L-1甘露醇+1.0%(w/v)纤维素酶R-10+1.5%(w/v)果胶酶,酶解时间为10 h,纯化后的原生质体产量和活力分别可达82.36×105 个·g-1和72.74%。以愈伤组织和悬浮细胞为分离材料的最佳酶液组成均为CPW-0.6 mol·L-1甘露醇+2.0%(w/v)纤维素酶R-10+0.5%(w/v)果胶酶,酶解12~14 h,纯化后的原生质体产量及活力分别为31.26×105 个·g-1、59.15%和53.87×105 个·g-1、63.92%。以花椒试管苗叶片为原生质体分离材料,分离纯化后的花椒原生质体在无激素的WPM培养基中,培养密度为1×105个·mL-1,培养第3天原生质体第1次分裂,2周分裂3~5次,原生质体28 d后形成微细胞团,培养60 d后可形成2 mm左右的愈伤组织。 相似文献
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为建立有效的原生质体分离体系,研究了黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)原生质体酶解分离纯化条件。结果表明:黑果腺肋花楸愈伤组织在20g/L纤维素酶+0.5g/L果胶酶+13%甘露醇+5mmol/LMES酶解液中黑暗静置酶解10h,可获得高产量高活力的原生质体;采用500r/min离心8min分离纯化效果最好;愈伤组织比组培苗叶片分离获得的原生质体产量与活力更高。 相似文献
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以菜豆幼嫩叶片为材料,研究了预处理、酶液组合、酶解时间、酶解方式、甘露醇浓度及纯化时的离心转速对菜豆叶片原生质体分离的影响。结果表明:菜豆叶片质壁分离1 h后,在2%纤维素酶+1%离析酶+10%甘露醇+0.1%BSA+5 mmol/L MES+10 mmol/L CaCl2·2H2O,pH为5.8的混合液中,(25±1)℃黑暗条件下振荡酶解12 h可获得大量有活力的绿色原生质体。纯化时400 r/min离心3 min效果较好。 相似文献
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矮牵牛叶肉原生质体分离条件的优化 总被引：1，自引：1，他引：0
以幼嫩叶片为试材,探讨了渗透压(甘露醇浓度)、水解酶浓度、酶解时间等关键因素对矮牵牛叶肉原生质体分离效果的影响。研究结果表明,以2%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23+0.4%离析酶R-10+20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+0.1%牛血清白蛋白(BSA)+0.11%无水氯化钙(CaCl_2)为酶解液,在0.5mol/L甘露醇浓度下静置酶解5h,1 100r/min离心2min沉淀原生质体,原生质体产量及活性分别为2.90×106个/g和88.1%,可为后续原生质体培养及融合提供材料。 相似文献
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[目的]筛选软枣猕猴桃原生质体最佳酶解液配方。[方法]以4种配方酶解液在相同条件下处理等量软枣猕猴桃叶片,比较最后收集的纯化原生质体量,筛选最佳酶解液配方。[结果]配方Ⅲ(1.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.3%果胶酶)和Ⅳ(1.0%纤维素酶、0.5%果胶酶)处理酶解效果要明显优于配方Ⅰ(2.0%纤维素酶、0.5%离析酶)、Ⅱ(2.0%纤维素酶、0.3%果胶酶)。[结论]配方Ⅲ(1.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.3%果胶酶)为软枣猕猴桃原生质体最佳酶解液配方。 相似文献
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【目的】研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。【方法】以F1株系S047（以屋久岛紫薇（L. fauriei）为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得）及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度（5,10,15,20,25,30 g/L）及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8 mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶（10,20,30 g/L）、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇（PEG）介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。【结果】分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15~20 g/L,离析酶质量浓度为5~10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×105 g-1,破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。【结论】获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。 相似文献
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为建立八仙花（Hydrangea macrophylla）有色原生质体游离体系,以八仙花萼片为试验材料,分别对材料的预处理方式、酶液组分、酶解时间、纯化离心力等影响酶解的关键因素进行研究。结果表明, 预处理方式选择分离花萼片上下表皮法,纤维素酶和离析酶水平分别为4%和0.4%（质量体积分数）,甘露醇0.6 mol·L-1,酶解液加热冷却后加入 0.1%（质量体积分数）BSA和10 mmol·L-1 CaCl2,酶解2 h,低温离心机4 ℃、1 426 r·min-1离心5 min,为最优的八仙花萼片原生质体游离条件。利用所建的原生质体游离体系对4个不同品种的八仙花萼片进行有色原生质体游离,200× 镜下单视野内可获得13~35个有色的原生质体;对有色原生质体进行液泡的H+流测定,发现蓝色液泡较粉色液泡H+流的外排趋势明显,说明同一八仙花品种蓝色液泡的pH高于粉色液泡。 相似文献
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研究了影响诱导矮牵牛(Petunia hybrid)形成愈伤组织和分离、纯化其原生质体效率的关键因素。结果表明,矮牵牛无菌苗叶片可在含1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和0.1 mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基上形成愈伤组织,用酶液(2%纤维素酶R-10 + 0.5%果胶酶Y-23 + 0.3%离析酶R-10,0.5 mol/L甘露醇)对继代培养10~15 d的愈伤组织在黑暗条件下静置酶解12 h,原生质体产量和活性分别达到3.4×106个/g 和83%。 相似文献
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《天津农业科学》2020,(6)
原生质体是进行单细胞测序和基因编辑研究的理想材料。为了研究不同酶解时间对灯盏花原生质体分离的影响,采用纤维素酶1%+果胶酶0.3%+半纤维素酶0.5%酶液处理愈伤组织悬浮细胞2,3,4,5,6 h,纤维素酶0.5%+果胶酶0.2%+离析酶0.5%酶液处理幼叶4,6,8,10,12,14,16 h。结果表明,不同酶解时间,灯盏花悬浮细胞和幼叶的原生质体产量及活力均差异显著。悬浮细胞酶解5 h,原生质体的产量和活力达到最高,分别为3.73×105个·g-1、75.84%;幼叶酶解12 h,原生质体产量最高,达到1.17×106个·g-1,酶解10 h,原生质体活力最高,为80.98%。叶片的原生质体产量和活力明显高于悬浮细胞。 相似文献
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利用组培技术,以宁杞1号枸杞和农大1号番茄种子的无菌苗叶片、下胚轴为外植体,脱分化培养分别获得其愈伤组织,经继代增殖和酶解处理获得质量较好的原生质体。结果表明,枸杞、番茄无菌苗的下胚轴分别在附加有1.0mg/L2,4-D+1.5mg/LKT和1.0mg/L2,4-D+1.0mg/LKT的MS固体培养基中诱导的愈伤组织(诱导率分别是68.45%、64.33%)无褐化或褐化率最低,产生的愈伤组织适合于原生质体培养且效果最好;将0.5%果胶酶、1%纤维素酶、0.2%离析酶R-10、0.2%半纤维素酶配合使用,在pH5.0~6.0、温度30℃下振荡酶解12~16h,所得枸杞、番茄原生质体均在Km8P液体培养基中纯化培养,原生质体及活力状态均可保持2d左右。 相似文献
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《西南农业学报》2019,(10)
【目的】为云南疣粒野生稻原生质体的培养、细胞融合、细胞再分化成植株奠定基础。【方法】测定不同酶解组合及浓度、酶解时间、渗透压稳定剂浓度下云南疣粒野生稻原生质体的产量和活力,同时筛选云南疣粒野生稻原生质体分离和培养的较优条件。【结果】优化后建立云南疣粒野生稻胚性悬浮细胞系的周期可缩短至45～60 d;在纤维素酶1.5%+果胶酶0.3%+甘露醇0.6 M+MES 5 mM+CaCl_(2 ) 5 mM条件下酶解2 h,云南疣粒野生稻原生质的产量为1.45×10~(6 )个/g·FW,活力达到90.17%,制备出的原生质体在固液培养下得到云南疣粒野生稻原生质体再生植株。【结论】建立了一套快速高效分离培养云南疣粒野生稻原生质体的体系,对研究重要植物资源、种质创新和发掘其优良基因具有重要意义。 相似文献
16.
【目的】探明提高人参果出汁率的工艺条件,为人参果果汁的开发应用奠定基础。【方法】采用单因素试验研究果胶酶、混合酶（纤维素酶和半纤维素酶按1∶1混合）及木瓜蛋白酶不同添加量（0.10～0.45 g/L）及其在不同温度（35～65℃）、pH（3～6）及作用时间（25～60 min）条件下对人参果出汁率的影响,并在此基础上采用分段酶解法对人参果汁的提取工艺进行优化。【结果】果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶混合酶、木瓜蛋白酶添加量分别为0.20 g/L、0.25 g/L、0.35 g/L,酶解温度为50℃,水解pH值为5.0,水解时间为45 min,采用果胶酶＋混合酶的分段处理方式为佳。分段酶解法制备人参果汁的最佳工艺条件：pH 5＋水浴温度45℃＋0.20 g/L果胶酶酶解35 min,保持体系pH 5＋水浴温度55℃＋0.25 g/L混合酶酶解45 min,经此方法处理人参果出汁率达92.5%。【结论】按照果胶酶+混合酶的分段水解方式能显著改善人参果果汁出汁率,对人参果的开发利用具有实际指导意义。 相似文献
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甘蓝型油菜子叶原生质体培养及植株再生研究 总被引：2，自引：1，他引：1
以甘蓝型油菜中双6号子叶为材料制备原生质体,采用固液结合培养,探讨了其原生质体分离、培养与再生的优化条件,获得了再生植株。结果表明:混合酶液(0.5%纤维素酶+0.1%果胶酶+0.2 mol/L甘露醇+80 mmol/L CaCl2)与SCM溶液按3∶7的比例混合,酶解14 h可获得高产率中双6号子叶原生质体;原生质体在前人设计的B、C固液相结合培养基上培养效果好;最佳分化培养基为E培养基+1.0 g/L 6-BA+0.1 g/L NAA+0.02 g/L GA3+30μmol/L AgNO3;所有再生芽均在无激素的MS培养基上生根。研究结果为建立成熟的甘蓝型油菜原生质体再生体系提供了新的配方与依据。 相似文献
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【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl2会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L-1 CaCl2的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L-1甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L-1甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L-1甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40% PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。 【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×106个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。 相似文献
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《西南农业学报》2020,(8)
【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件。最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证。【结果】原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%果胶酶、0.1 mol/L CaCl_2、0.2 mol/L KCl、1%BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40 r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD_(600))为1、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率。【结论】成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究。 相似文献