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1.
植物样本保存方法不当易导致样本枯萎和腐烂，严重影响病毒检测结果。为提高PCR法检测草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus，SMoV）的效果，明确待检测植物样本的有效保存条件，将经过RT-PCR检测感染SMoV的草莓叶片作为试验材料，设置自然风干保存、硅胶干燥保存和氧化钙（CaO）干燥保存3种不同的干燥保存条件。采用试剂盒法提取各处理草莓叶片总RNA，设计特异性引物进行RT-PCR检测。比较得到最佳干燥保存条件后，再以几种常见的低温、干燥保存为对照，分析草莓叶片不同保存方法对草莓斑驳病毒PCR检测效果的影响。电泳结果显示，含有SMoV的草莓叶片在CaO干燥保存条件下PCR检测效果最好，且操作简单易行。该方法可以为高效、便捷的保存带毒草莓叶片样本提供参考，适用于田间大量样品的采集，提高检测效率。 相似文献
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目前,草莓主要有3种病毒侵染,本研究通过改进CTAB法对经过茎尖剥离的组培四季草莓叶片提取总核酸,采用多重RT-PCR技术同时检测草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒。电泳结果显示提取的总核酸中可见总DNA条带和完整的RNA条带,并采用两步法RT-PCR获得了目的条带。本研究建立了多重RT-PCR同时检测草莓病毒的技术体系。 相似文献
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草莓microRNA的RT-PCR鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】microRNAs（miRNAs）在植物的生长发育过程中起着重要作用,本研究旨在建立一种快速准确地鉴定草莓中保守miRNA的方法。【方法】以草莓叶片为试材,在利用改进的CTAB法成功富集小于150 bp的小分子RNA的基础之上,采用3′端加接头、5′端和3′端两端加接头、利用茎环等3种RT-PCR策略来检测鉴定草莓中保守miRNA,同时比较总核酸、总RNA和小分子RNA等不同种类的模板对利用茎环RT-PCR检测miRNA的影响。【结果】对于植物中20种miRNAs,通过3′端加接头方式鉴定出7种;通过两端加接头方式鉴定出1种;而利用茎环的方式鉴定出15种。分别以3种核酸为模板的茎环RT-PCR的扩增效果没有差异。【结论】总核酸的提取是最快速最简单的,因此,以总核酸为模板,利用茎环RT-PCR是鉴定植物中miRNA的最简便快速而有效的方法,这种方法的可行性已在苹果、葡萄等植物上得到验证。 相似文献
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草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。 相似文献
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【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。 相似文献
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分析草莓种质资源的病毒携带情况,为草莓脱毒种苗的繁育和病毒病的防治提供依据。针对保存的86份栽培草莓材料,分别提取每份材料的叶片总RNA,将待测草莓总RNA混样,然后采用高通量测序技术进行测序。根据每种病毒的序列保守区设计引物,采用RT-PCR对高通量测序的结果进行验证。利用设计的引物分别对每份草莓品种材料进行RT-PCR检测,明确每份材料的带毒情况。测序结果表明,从86份草莓资源中检测出3种病毒,分别为草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,简称SMoV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,简称SVBV)和草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus,简称SPaV),该结果与RT-PCR验证的结果相符。在所有86份供试样品中,28份材料带有病毒,病毒感染率为32.56%;其中,23份材料带有SVBV;11份材料带有SMoV;5份材料带有SPaV。单一病毒侵染样品18份,复合侵染材料共10份,草莓种苗带毒率高,草莓病毒病危害严重。 相似文献
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[目的]通过对反应条件和参数的摸索与优化,建立多重RT-PCR检测方法,实现2种病毒的同时高效快速检测。[方法]通过CTAB法与试剂盒提取RNA,以优质的总RNA为模板,进行梯度PCR,结合扩增内标的检测体系,建立多重RT-PCR检测方法。[结果]建立了优化的SCV和SVBV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。[结论]该研究为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法,为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。 相似文献
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【目的】探讨榛子总RNA提取的有效方法,为今后开展榛子的分子生物学等研究奠定基础。【方法】以榛子的成龄叶片、幼嫩叶片和雄花芽为试材,采用植物RNA提取试剂盒、Trizol法、改良的CTAB法Ⅰ、改良的CTAB法Ⅱ、CTAB法和改良的SDS法提取其总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和PCR检测所提取总RNA样品的品质。【结果】除了Trizol法,其他5种方法都能提取到总RNA,但是改良的CTAB法Ⅰ更适合榛子幼嫩叶片、成龄叶片和雄花芽总RNA的提取,此方法提得的总RNA较完整,条带清晰,品质较优,28SrRNA亮度约是18SrRNA的2倍,且无降解现象。经RT-PCR验证,以改良的CTAB法Ⅰ提取的RNA为模板扩增得到的条带清晰,与目的片段大小一致,能够满足后续试验的要求。【结论】改良的CTAB法Ⅰ是榛子幼嫩叶片、成龄叶片和雄花芽等组织总RNA提取的最有效方法。 相似文献
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新疆地区四种草莓病毒病原的检测 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】研究新疆草莓病毒病病源种类及田间发生情况,建立主要病毒病原多重RT-PCR检测体系,为无病毒草莓生产提供理论和技术支持。【方法】利用已报道的4种草莓主要病毒病原4对特异性引物,分别对新疆主要草莓种植区采集表现疑似病毒病症状的草莓样品共450份,采用单一反转录PCR(RT-PCR)及多重PCR对采集的样品进行检测,分析新疆草莓病毒病的发生情况。【结果】感染新疆草莓有3种主要病毒,南北疆15个不同栽培区均能检测出这3种病毒,每个采集地的病毒检出率均在26%以上。所有样品中病毒总检出率为64.22%;其中,草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)检出率最高,为51.78%;草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)检出率为23.78%,草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)检出率为9.33%,草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)没有检出。病毒复合侵染率达18.45%,两种病毒病复合侵染检出率为16.67%,三种病毒病复合侵染检出率为1.78%;所有样品中对3种病毒的多重RT-PCR与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】新疆草莓受SVBV、SMoV和SMYEV三种病毒危害,单一病毒病感染率以及两种以上病毒复合侵染侵染率都较高,在无病毒种苗的培育和生产中加强病毒检测。 相似文献
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【目的】旨在建立‘红颜’草莓组织快繁体系。【方法】以‘红颜’草莓茎尖为试材,用茎尖组织培养法和RT-PCR方法,研究不同培养基对其茎尖萌发率、不定芽增殖、生根率等的影响,并检测常见的5种草莓病毒(草莓轻型黄边病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒和黄瓜花叶病毒)。【结果】适宜‘红颜’草莓初代培养基为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 1 g/L,继代培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+PVP 1 g/L,生根培养基为1/2MS+IBA 0.4 mg/L,移栽基质为草炭、蛭石和珍珠岩(体积比为2∶1∶1)。利用RT-PCR方法检测草莓病毒的脱除效果,脱除率为64.1%。【结论】该试验获得稳定的‘红颜’草莓组织快繁体系,为草莓产业高质量发展提供基础。 相似文献
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【研究目的】为建立适于富含多糖和多酚等物质的龙眼果皮总RNA提取的方法;【方法】采用TRIzoL法、Tris-硼酸法和改良CTAB法提取龙眼果皮的总RNA。并通过凝胶电泳、紫外分光光度法检测提取的RNA样品的品质;【结果】改良CTAB法、Tris-硼酸法所提取的RNA经电泳检测。28SrRNA和18SrRNA条带清晰。RT-PCR得到的条带与目的片断大小一致。说明所提取的RNA纯度高、质量好;TRJZOL法所得到的RNA降解严重,没有得到完整的电泳条带;【结论】改良CTAB法和Tris-硼酸法适于富含多糖和多酚等物质的龙眼果皮总RNA的提取。 相似文献
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【目的】筛选适合棉纤维总RNA的提取方法,并对其进行改良,以满足转录组和表达谱测序要求。【方法】采用三种方法提取棉纤维总RNA,即改良的热硼酸法、Trizol法和离心柱试剂盒法。【结果】改良的热硼酸法提取的棉纤维总RNA质量最好,同时对该方法的改良更适合不同时期相同棉花品种和相同时期不同棉花品种棉纤维总RNA的提取。【结论】通过比较棉纤维总RNA的提取方法,发现改良的热硼酸法提取棉纤维总RNA质量最好,且对该方法的改良提取的总RNA更能够满足转录组和表达谱测序的要求。 相似文献
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李丽丽 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2014,40(3)
为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。 相似文献
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【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、... 相似文献
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【研究目的】寻找烟草各个组织总RNA最佳的提取方法。【方法】以烟草K326的根、茎、叶、蕾、花和种子为材料,分别采用试剂盒法、Trizol法和CTAB法提取烟草6个组织总RNA进行对比。【结果】烟草不同组织总RNA提取方法有所不同,试剂盒法和Trizol法只能提取出根、茎、叶、蕾和花的总RNA,而不能提取种子总RNA;CTAB法能提取出6个组织的RNA。3种方法提取的RNA质量好,均能满足RT-PCR以及后续实验的要求。【结论】试剂盒法较Trizol法和CTAB法简单、快捷,适合于烟草除种子以外其余组织总RNA快速提取,CTAB法适合烟草所有组织总RNA提取。 相似文献
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【目的】为了提高草莓的果实品质和经济价值。【方法】利用改良CTAB法提取五叶草莓叶片总DNA,反向PCR(IPCR)方法克隆基因。【结果】得到了2条完整的草莓多酚氧化酶基因全长3 591bp和1 809bp,分别编码1 196和602个氨基酸,分别命名为FpPPO1与FpPPO_2,GenBank登录号分别为HM063946和HM063947。FpPPO1和FpPPO_2与其他物种中的多酚氧化酶基因比较,氨基酸相似性分别为57%~77%与74%~99%。最后成功构建了多酚氧化酶基因反义植物表达载体pCP430和正义植物表达载体pCP1809。【结论】克隆得到草莓FpPPO1和FpPPO_2基因全长并构建转基因载体,为研究草莓中多酚氧化酶基因的功能奠定了基础。 相似文献
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【目的】对草莓酚类物质的提取工艺条件进行优化,为研究开发草莓中的活性成分提供参考。【方法】以日本引进的＂丰香＂草莓为试材,采用有机溶剂法进行酚类物质提取,探讨提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间等因素对草莓酚类物质提取率的影响,并通过L9（34）正交试验对各影响因素进行优化分析。【结果】提取温度、乙醇浓度、料液比、浸提时间对草莓酚类物质提取率的影响显著,显著性大小依次为：料液比〉提取温度〉乙醇浓度〉提取时间。草莓酚类物质的最佳提取工艺条件为：提取温度40℃,乙醇浓度70%,料液比1∶20,提取时间40min,在此工艺条件下草莓酚类物质提取率平均水平达0.845mg/g。【结论】优化后的提取工艺适合于工业生产,可为草莓精深加工产品的进一步开发打下基础。 相似文献
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【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县（区）种植2～3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为620 bp目的片段,可知这些马铃薯均感染了X病毒。不同CP基因序列之间存在微小变异,8个县(区)样品间CP基因的序列一致性在95.2%～99.4%,与国内外其他地区12个样品CP基因的序列一致性在92.9%～98.5%。系统进化树显示,将X病毒可分为4个类群,而陕北8县(区) 马铃薯X病毒归属于其中的2个类群。【结论】马铃薯X病毒在陕北地区普遍存在,RT-PCR方法可快速、准确地检测到马铃薯X病毒,X病毒CP基因存在一定程度的变异。 相似文献