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1.
王公金 《农业生物技术学报》2008,16(5)
本研究介绍了猪卵母细胞第一极体(PbΙ)的体外成熟培养、分离与回收及其保存方法,为进一步利用极体作为核供体重组猪卵母细胞研究提供了必要的参考依据。通过屠宰场废弃的猪卵巢卵母细胞的体外成熟培养（IVM）技术途径获得成熟卵母细胞，对体外培养成熟卵母细胞PbΙ排出、活性及其形态学进行了统计分析；分别采用酶消化和显微操作两种方法进行了PbΙ分离与采集，继而进一步结合台盼蓝细胞染色法，探讨了不同温度保存条件下PbΙ存活情况。结果表明：卵泡卵母细胞IVM 40h后发现大量高活性PbΙ；显微操作分离极体效果显著优于酶消化法，且分离的PbΙ活力高，完整性好。39℃条件下大多数采集的PbΙ存活时间仅有4 h，4℃条件下保存40小时存活率可达85.0%%；-20 ℃保存1 wk达95.0%，而超低温冷冻长期保存存活率和形态正常率分别达89.1%和97.8%。 相似文献
2.
小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育 总被引：1，自引：0，他引：1
分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据. 相似文献
3.
水牛卵母细胞成熟时间对核移植效果的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
主要探讨水牛卵母细胞的成熟时间对其体细胞核移植效果的影响,结果表明,在体外成熟(IVM16～24h)期间,不同的去核时间对水牛卵母细胞核移植后的融合率、分裂率和囊胚发育率都没有显著影响(P>0.05),但卵母细胞去核后的注核存活率,IVM16～18h组与IVM22～24h组有极显著差别(P<0.01)。经6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制成熟培养的卵母细胞,再成熟培养16～18h后,与直接在体外成熟培养16～18h的卵母细胞的融合率、分裂率和囊胚发育率相比,均无显著影响(P>0.05)。水牛卵母细胞的成熟时间对其核移植效果无明显影响,6-DMAP可用于调整水牛卵母细胞的去核操作时间。 相似文献
4.
OPS法玻璃化冷冻牛卵母细胞和囊胚 总被引：13，自引：5，他引：13
本文报道了利用拉细开口型细管 (Open Pulled Straw,OPS)方法进行玻璃化冷冻保存体外成熟(IVM)的牛卵母细胞及体外生产 (IVP)的牛囊胚的实验结果。实验 1的牛卵母细胞冷冻处理分 2组 ,组 1(G1 )是将卵母细胞在 IVM2 1 h时去除部分卵丘细胞后马上进行冷冻处理。组 2 (G2 )卵母细胞在 IVM6h时去除部分卵丘细胞 ,然后继续培养至 2 2 h冷冻 ;冷冻后的卵母细胞在液氮中保存 0 .5～ 2 h后解冻再继续 IVM1 h后与正常 IVM2 4h的对照组卵母细胞一起进行体外受精 (IVF)处理。实验 2则冷冻了来自IVP的 6、 7日龄的牛囊胚。结果显示 ,G1的卵母细胞 IVF后 8d的囊胚率 (2 2 .8% ,2 6/1 1 4)和孵化囊胚率 (1 4.9% ,1 7/1 1 4)都极显著地高于 G2 (分别为 2 .9% ,5 /1 71和 0 .5 % ,1 /1 71 ,P<0 .0 0 1 ) ;但两处理组的受精卵裂率差别不大 (分别为 48.2 %和 41 .5 % ,P>0 .3 )。冷冻第 6d和第 7d的体外囊胚 ,其冻后存活率和囊胚孵化率分别为 92 .7%、 89.2 %和 83 .6%、 66.7%。结果表明 ,利用 OPS法玻璃化冷冻经体外培养成熟的牛卵母细胞及体外生产的牛囊胚均能获得良好的效果 相似文献
5.
王公金 《农业生物技术学报》2008,16(1)
本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠（即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠）为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体（COCs）,利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体（PbI）;以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明：注射hCG后12～14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。 相似文献
6.
彗星试验检测体外培养山羊卵母细胞的老化程度 总被引：1，自引：0，他引：1
为提高体外成熟山羊卵母细胞利用率,减少因卵母细胞老化而造成的质量下降,本研究通过彗星试验对体外成熟培养山羊(Capra hircus)卵母细胞的DNA受损程度进行研究。结果表明,随着成熟培养时间的延长,尤其是培养时间超过24h以后,卵母细胞的极体逐渐退化,其DNA损伤程度明显增加,卵母细胞凋亡和老化的现象越来越严重。在体外成熟培养24h之内,检测到极体的卵母细胞的比例随着培养时间的延长而显著增加(20h,(45.74±2.67)%;22h,(66.11±1.12)%),卵母细胞平均彗尾长度均小于100μm,其中有极体卵母细胞彗尾长度在0～50μm之间的比例(20h,(77.27±2.27)%;22h,(40.12±1.55)%)小于无极体卵母细胞(20h,(83.86±1.34)%;22h,(51.39±8.45)%)。体外成熟培养24h时,有极体的卵母细胞比例达到最高值(80.19±2.07)%,有极体和无极体卵母细胞的平均彗尾长度基本相同((96.08±4.52)μmvs(95.25±9.28)μm),有极体卵母细胞的彗尾分布主要以50～100μm((45.71±0.50)%)和100～150μm((35.45±2.92)%)区段为主,而无极体卵母细胞主要分布在0～50μm((30.92±4.02)%)和50～100μm((33.02±3.23)%)两个区段。当培养时间超过26h以后,有极体的卵母细胞比例显著下降(26h,(72.01±2.88)%;28h,(59.77±3.59)%);无论是有极体或无极体的卵母细胞,其平均彗尾长度都继续增加,彗尾长度分布在150μm以上的卵母细胞比例迅速增加。培养至30h时,有极体的卵母细胞比例下降至(46.34±2.07)%,其平均彗尾长度为(180.11±10.33)μm,彗尾长度分布在150μm以上的比例为(58.33±4.81)%;无极体卵母细胞平均彗尾长度为(270±17.72)μm,彗尾长度分布在150μm以上的比例为(80.95±2.38)%,均高于有极体卵母细胞。本研究结果表明,山羊卵母细胞在体外成熟后会逐渐老化,尤其是在成熟培养时间超过24h后,老化卵母细胞比例显著增加。本研究可使我们对卵母细胞老化的机理有了更进一步的了解和认识,有助于通过减少卵母细胞老化来提高卵母细胞的质量。 相似文献
7.
卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。 相似文献
8.
本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究. 相似文献
9.
通过研究不同受体胞质对核移植效果的影响,结果发现:部分体外成熟16~18 h的牛卵母细胞,其细胞核已完成成熟,胞质可直接用于核移植而不需进行激活处理,直接进行核移植囊胚率达7.7%;体外成熟培养(IVM)30 h的TⅡ期受体胞质较IVM 20~22 h激活的TⅡ期胞质核移植效果差,不适宜作受体胞质;MⅡ期胞质核移植效果优于TⅡ期胞质,两组囊胚率分别为11.7%和5.2%(P<0.05)。 相似文献
10.
在卵母细胞成熟过程中,细胞周期蛋白A2(CyclinA2,CycA2)可与不同周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK)相互作用,通过其周期性表达和降解,参与调控细胞周期.为探讨CycA2基因对猪(Sus scrofa)卵母细胞体外成熟的影响,本研究从猪卵巢中克隆CycA2基因,构建野生型pVenus-CycA2和非降解型pVenus-DN157CycA2真核表达载体,转染至hela细胞,确认重组质粒的表达及定位情况.将pVenus-CycA2、pVenus-DN157CycA2体外转录为cRNA,对猪卵母细胞进行显微注射后,体外成熟培养一段时间后统计第一极体排出率,并观察其表达和定位.结果显示,显微注射了pVenus-CycA2、pVenusDN 157CycA2cRNA的卵母细胞,其第一极体(first polar body,PBl)的排出率与对照组相比极其显著降低(P＜0.001,);用Roscovitine处理的pVenus-DN 157CycA2表达的卵可恢复排出PB1的能力,其PB1排出率与对照组相比差异不显著.本研究首次揭示了CycA2基因对猪卵母细胞体外成熟过程的影响,为探索CycA2参与染色体分离调控的分子机制提供理论依据,同时也为进一步研究第二次减数分裂过程中CycA2基因的作用提供了一个平台. 相似文献