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葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测 总被引：1，自引：0，他引：1
研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。 相似文献
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4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测 总被引：4，自引：0，他引：4
葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。 相似文献
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根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3μmol·L~(-1)。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。 相似文献
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根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。 相似文献
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通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。 相似文献
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夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物, 建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物, 退火温度54℃, 引物浓度0.6 μmol/L的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域, 所得标准曲线扩增效率为102.77%, 决定系数为0.996 1, 最低检测浓度为2.370×10 2 拷贝/μL, 灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测, 发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV, 定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累, 发现26~28℃下病毒积累速度最快, 且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测, 共检出71份阳性样品, 检出率为93.4%。综上, 本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强, 灵敏度高, 适于TeMV的快速检测。 相似文献
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三种分子检测体系的比较及柑橘果园黄龙病监测 总被引：5，自引：5，他引：0
为了评价3种PCR分子检测体系对柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)大田诊断效果,综合比较了常规PCR、巢式PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(SG Ⅰ-qPCR)方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度、特异性和准确度等参数,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR监测广西柑橘园疑似HLB样品425个,比较了2种检测体系的阳性检出率。基于CQULA04F/CQULA04R引物对的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的灵敏度可达10 ag/μL;而巢式PCR灵敏度为100 ag/μL,巢式PCR较常规PCR检测灵敏度高104倍。疑似样品的HLB病原SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR检出率分别为46.6%、40.0%。各检测体系的灵敏性、特异性、符合度依次为SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR>巢式PCR>常规PCR。研究表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR可作为果园大规模HLB早期诊断和监测的首选,而在缺乏定量检测仪器时,巢式PCR也可用于HLB的检测,但需注意避免空气污染导致的假阳性。 相似文献