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1.
冯洁 《农业生物技术学报》2008,16(1)
植物青枯菌II型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌II型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,我们通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌II型分泌系统的全部12个gsp基因。分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达,为GSP蛋白之间的互作研究奠定了基础 相似文献
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酵母双杂交系统的建立为在体外研究蛋白质问的相互作用提供了可能，在验证植物与病原物相互识别过程中是否发生蛋白质与蛋白质的互作及研究植物抗病信号传递链中发挥了不可替代的重要作用。本研究以马铃薯抗病蛋白API编码基因为诱饵，从cDNA文库中捕获与API发生互作的蛋白，研究围绕API蛋白的与抗病有关信号传导途径。 相似文献
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番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。 相似文献
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应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因 总被引：3，自引：0，他引：3
植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。 相似文献
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水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。前期研究发现Xoo PXO99A中一个编码Ⅲ型效应物的PXO_03420（hpaF）基因与病菌游动性、致病性和致敏性有关,为探讨hpaF基因编码产物在病菌与日本晴水稻中的互作关系,本研究采用Matchmaker酵母双杂交系统构建了日本晴水稻叶片高质量cDNA文库,文库重组率为87.6%,滴度为2.57×10^6pfu/mL。将文库与构建的Y187/pGBKT7_03420诱饵进行酵母双杂交,共得到26个阳性克隆。通过对阳性克隆测序所得结果进行结构域分析,初步鉴定HpaF与水稻叶片中具有WHY或PRK结构域的两个蛋白存在互作关系。本研究结果为进一步研究hpaF基因的功能奠定了基础。 相似文献
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克隆植物早期结瘤素基因ENOD40的受体基因 总被引：1，自引：0，他引：1
ENOD40是根瘤器官形成过程中表达的植物早期结瘤素基因之一,通过调节细胞生长素和细胞激动素的平衡诱使根瘤形成.利用DupLex-A酵母双杂交系统,以豌豆ENOD40为诱饵,从豌豆根瘤的cDNA文库2.5x106个克隆中筛选了5个可能的ENOD40受体蛋白基因,以期了解调节ENOD40基因功能的分子机制,揭示根瘤形成过程中信号传导.DNA测序及同源性比较显示,4个克隆虽未在GenBank中找到同源性相近基因,仍有研究价值;1个克隆B'29编码的蛋白质与Laminin类受体蛋白有80%的同源性,作用机制可能相似,在根瘤形成过程中传递信号.但这5个可能的克隆还需进一步验证真伪,以便确认ENOD40是否可与多个基因作用或这几个克隆之间存在相关性. 相似文献
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青枯病是世界上最为严重的植物细菌性病害之一，生物防治是防控其危害的热点研究领域，而分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制。本研究在前期筛选到对青枯菌有良好拮抗活性的短短芽孢杆菌B011(Brevibacillus brevis B011)基础上，采用色谱法分离纯化到抗青枯菌的主要活性物质，通过串联质谱和核磁波谱分析方法鉴定了其结构，并根据B011菌株全基因组序列，预测了活性化合物生物合成相关基因及其合成途径。结果表明，B. brevis B011次生代谢物中抑制青枯菌的主效活性物质为伊短菌素A(edeine A)，次效活性物质为N-乙酰基色胺[N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)acetamide]。这两种化合物对青枯菌的抑制活性为首次报道。基因簇预测结果表明，B011菌株基因组中存在完整的edeine合成基因簇，共包括17个基因，即ede A～ede Q，且基因簇中的基因结构完整，基因序列高度保守。B011基因组中有多个N-乙酰基色胺的生物合成相关基因，包括17个脱羧酶编码基因和54个乙酰转移酶编码基因，可能分别参与色氨酸脱羧反应和色胺的乙酰基转移反应... 相似文献
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基于BOX-PCR和REP-PCR技术青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
青枯雷尔氏菌(Ralstonias olanace arum)能够对许多重要作物引起致命性萎蔫病害,广泛分布在热带、亚热带以及温带地区.研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义.本研究利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌,结果表明,这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带.同时采用BOX插入因子PCR(BOX-PCR)和重复基因外回文序列PCR(REP-PCR)对这些菌株进行基因多样性研究,基于它们所扩增出的基因指纹图谱表明,BOX-PCR扩增出19条特异性条带,REP-PCR扩增出20条特异性条带.系统聚类结果表明,青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,其中,寄主植物是在遗传差异中起主导作用.进一步分析可知,地域性的差异主要由BOX-PCR提供,寄主间的差异主要由REP-PCR提供.不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带,在REP-PCR中同样具有与各个寄主相对应的特异性条带,利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌.BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径. 相似文献
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细菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat)可严重影响动植物病原细菌的致病性,为了研究Tat与西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)致病性的关系,本研究通过同源重组的方法构建了西瓜嗜酸菌的tatB基因缺失菌株(ΔtatB)以及互补菌株(CtatB),并从西瓜嗜酸菌致病能力、游动能力、生长能力、胞外多糖与胞外纤维素酶产生能力以及生物膜形成等方面阐明Tat系统对西瓜嗜酸菌的影响。实时荧光定量PCR探究tatB基因与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrcN)和(hrpE)、Tat转运系统相关基因(Aave_1810)和(Aave_0034)以及细胞毒性相关基因(TrbC)的关系。结果表明,ΔtatB能够引起非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应;tatB基因的缺失导致了嗜酸菌的致病力、游动能力和对数生长初期的生长能力下降;不影响西瓜嗜酸菌胞外多糖、胞外纤维素酶的产生以及生物膜的形成;导致了TrbC和hrcN基因表达量显著升高,Aave_1810、Aave_0034和hrpE基因的表达量显著降低。研究结果表明,Tat系统相关基因tatB的缺失会影响西瓜嗜酸菌一些生物学特性,并导致病菌致病能力降低。本研究为西瓜嗜酸菌Ⅲ型分泌系统外的其他分泌系统与致病性的关系研究提供了基础资料。 相似文献
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植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。 相似文献
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病原青枯菌土壤存活的影响因素研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
土传青枯病是一种毁灭性的细菌性病害,广泛分布于热带、亚热带和温带地区,严重威胁世界粮食安全。病原青枯菌主要从土壤中侵染作物根系,其在土壤中存活能力强,因此防治极为困难。明确病原青枯菌土壤存活的关键影响因素有助于开发高效阻控土传青枯病的措施。国内外学者在青枯菌的土壤存活方面开展了大量研究,但由于影响青枯菌土壤存活的因素复杂,而相关研究多围绕单一因素展开,缺乏针对青枯菌土壤存活规律和影响因素的系统性认识。本文系统梳理了青枯菌的自身特性（基因、行为和代谢产物）及土壤生物、非生物因素对其在土壤中存活的影响,阐明了青枯菌在寄主存在时土体存活、向寄主根表方向运动迁移时根际存活以及入侵寄主根系时根表存活的主要影响因子,以期为土传青枯病的系统阻控提供参考。 相似文献
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青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。 相似文献
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非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×107 CFU,次级文库总克隆数为1.6×107 CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×107 cells·mL-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本... 相似文献
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由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×106 CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×109 CFU·mL-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。 相似文献
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青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化严重.为了解福建省青枯雷尔雷氏菌的致病力类型及与无毒基因组成关系,本研究以弱化指数为指标,对福建省内不同地区和寄主的63个青枯雷尔氏菌进行致病力测定,结果表明,供试的青枯雷尔氏菌可分为3种致病力类型:强致病力、过渡型和无致病力;进一步对供试菌株进行无毒基因avrA、popP1和popP2的检测,3个无毒基因分布频率不同,avrA基因分布频率最高,达79.37％,popP1基因的分布频率最低为46.03％;不同寄主的菌株无毒基因组成不同,番茄(Lycopersicum esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)寄主以分布3种和2种无毒基因为主,茄子(Solanum melongena)寄主主要分布2种无毒基因,花生(Arachis hypogaea)寄主的菌株无毒基因分布较少,只分布1种avrA基因或没有检测到无毒基因;不同地域的菌株无毒基因组成不同,以番茄寄主为例,建瓯玉山镇的菌株分布3种和2种无毒基因为主,分别占45.45％和31.82％,宁德屏南菌株中3个无毒基因均等分布,福州北峰菌株中只分布avrA和popP2基因,二者均等分布,福州营口菌株中popP2基因分布频率最高,达60.00％;不同致病力的菌株无毒基因组成不同,无致病力菌株分布3种和2种无毒基因为主,过渡型菌株分布2种无毒基因为主,而强致病力菌株分布1种无毒基因为主;青枯雷尔氏菌的无毒基因组成与致病力相关性分析表明,3个无毒基因分布均与致病力呈正相关,其中popP1基因与菌株致病力相关性最高,达显著水平,其皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)值为0.31.本研究为植物青枯病预警和防控提供重要信息. 相似文献
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插入序列(insertion sequence,IS)元件可以插入到基因或DNA序列,其可能在生物体进化中起着重要的作用。ISRso21是在青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)FJAT-1458菌株中发现的一个新的插入序列。根据序列分析可知,该插入序列是属于ISL3家族中的一个成员。本研究发现,福建闽北地区菌株ISRso21的阳性率高于其他地区的趋势,不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布有显著性差异,ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此,由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同,从而导致青枯雷尔氏菌致病性的差异。研究表明,由于ISRso21的插入导致表现型转换系统转录调控因子A(phc A)的重排可能在青枯雷尔氏菌的致病性起着极其重要的作用。在所有菌株中,ISRso21在phc A基因上游中插入的检出率达到4.71%,其中无致病力菌株和强致病力菌株中的检出率分别为28.57%和0.00%。而ISRso21在二氨基庚二酸脱羧酶基因中的插入可能是为了更好地适应环境。ISRso21在不同致病性青枯雷尔氏菌中的插入位点的研究,可能为揭示青枯雷尔氏菌致病性机制提供新的研究途径。 相似文献
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瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用. 相似文献
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为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×107 CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。 相似文献
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水稻抗稻瘟病防御系统中草酸氧化酶的鉴定 总被引：8，自引：0，他引：8
以水稻(Oryza sativa)OSK3蛋白激酶为诱饵，利用酵母双杂交系统中从水稻cDNA文库中筛选与其互作的蛋白，与植物抗病性相关的草酸氧化酶编码基因是所获得的阳性克隆之一，经检测报告基因lac Z的表达验证了互作的真实性。认为属于H2O2产生酶类的草酸氧化酶在水稻OSK3蛋白激酶介导的抗病途径中，可能是位于抗病信号传导链下游的蛋白。 相似文献
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酿酒酵母耐铜基因CUP1的克隆及其植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
酿酒酵母铜金属硫蛋白（ｃｏｐｐｅｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,Ｃｕ－ＭＴ）,属于第Ⅱ型金属硫蛋白,Ｃｕ－ＭＴ由酿酒酵母耐铜基因ＣＵＰ１编码,由６１个氨基酸残基组成,其中半胱氨酸残基１３个,占Ｃｕ－ＭＴ总氨基酸数的２１．３％,Ｃｕ－ＭＴ与铜离子有较强的结合力,在酵母细胞中主要参与过量铜的解毒作用。本研究通过ＰＣＲ方法,从酵母基因组ＤＮＡ中扩增出了ＣＵＰ１基因,克隆于ｐＵＣ１９的多克隆拉点。扩增 相似文献