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以桃小食心虫(Carposina niponensis Walsingham)为材料,分别采用CTAB法,冰KAc法,SDS-PK法和试剂盒法提取桃小食心虫的基因组DNA.通过电泳、紫外光谱分析和ISSR-PCR扩增等检测手段,比较分析了DNA纯度.结果表明:CTAB法和SDS-PK法提取的DNA质量明显优于冰KAc法和试剂盒法,适用于PCR扩增.与其他方法比较,SDS-PK法提取的DNA经过PCR扩增后得到的多态性位点最多.因此,SDS-PK法是实验室提取桃小食心虫基因组有效、经济实用的方法. 相似文献
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单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较 总被引：1，自引：0，他引：1
为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不同方法均能扩增出234 bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板检出限最低,为1.25 x 10,CFU/mL.结论为,溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究. 相似文献
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【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。 相似文献
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基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫快速分子检测技术 总被引：1，自引：2，他引：1
【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA（RAPD）和特征序列扩增区域（SCAR）标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。 相似文献
5.
《贵州农业科学》2015,(12)
真菌的细胞壁,增加了提取基因组DNA的难度,为找到满足竹黄菌全基因组序列分析的高质量DNA的提取方法,分别使用改良CTAB法、蛋白酶K法和高盐沉淀法提取竹黄菌菌丝体的基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测定浓度和纯度、ITS序列的PCR扩增和酶切检测。结果表明:3种方法提取等量竹黄菌菌丝体的基因组DNA,蛋白酶K法和高盐沉淀法均能得到较为完整的且大于15kb的DNA,改良CTAB法DNA发生降解;通过PCR和酶切检测,3种方法所得基因组DNA均能有效地进行相应的酶反应。综合考虑基因组DNA的浓度、纯度、完整性和有无降解等,蛋白酶K法提取得到的基因组DNA(浓度为233.495ng/μL,OD_(260)/OD_(280)为1.806)最适用于全基因组的序列分析。 相似文献
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基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。 相似文献
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犬弓首蛔虫卵卵壳裂解方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为犬弓首蛔虫卵壳的鉴定奠定基础.[方法]采用3种联合作用方法对犬弓首蛔虫卵壳进行裂解,提取虫卵基因组DNA,然后用犬弓首蛔虫的ITS2特异性引物进行PCR扩增.[结果]DNA提取试剂对虫卵卵壳的作用不明显,PCR扩增结果未见预期片段;冻融后抽提DNA对虫卵卵壳有一定作用,但大多数虫卵还保留基本形态,PCR扩增结果也未见预期片段;冻融15次+蛋白酶K消化2次过夜,然后抽提DNA,虫卵大多数被裂解,利用PCR扩增到目的片段.[结论]破坏犬弓首蛔虫卵的卵壳采用冻融+蛋白酶K消化的联合方式效果明显,关键因素是作用时间. 相似文献
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天牛基因组DNA提取方法和标本保存方式的比较研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为天牛的分子系统学研究奠定基础。[方法]采用不同提取方法(饱和NaCl法、CTAB法、SDS-蛋白酶K消化法)从不同保存条件下天牛标本中提取基因组DNA,进行RAPD扩增,比较不同保存条件和不同DNA提取方法对DNA提取质量的影响,探索天牛标本的最佳保存方式和最佳DNA提取方法。[结果]不同方法提取的DNA质量有明显差异。CTAB法和SDS-蛋白酶K消化法提取的DNA质量较好,条带清晰完整,无降解和RNA污染。但饱和NaCl法的提取效果较差。天牛标本的最佳保存条件为在-80℃条件下无水乙醇浸泡。CTAB法提取的天牛基因组DNA能扩增出稳定清晰的多态性片段。[结论]CTAB法提取的天牛DNA质量最好,可直接用于PCR扩增。 相似文献
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橡胶白粉菌(Oidium heveae Steinmann)基因组DNA的提取方法 总被引：2，自引：0，他引：2
比较了2种菌源、3种方法提取橡胶树白粉病病原真菌橡胶白粉菌(Oidium heveae BA.Steinmann)基因组DNA的效果。结果表明:无论采用单斑分离法收集还是直接收集橡胶白粉菌菌体,无论采用石英砂振荡破壁法、氯化苄法还是尿素法提取,均能获得满足常规分子生物学操作要求的基因组DNA;在基因组DNA的提取产率、完整性方面,各种方式之间略有差异,但无显著差别;2种来源菌体的基因组DNA的ITS序列分析结果一致,说明在无法进行单斑分离的情况下,可以利用直接收集的菌体提取基因组DNA。 相似文献
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4种高粱基因组DNA快速提取方法的比较 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]寻找快速、简单、成本低的高粱基因组DNA提取方法。[方法]首先,分别使用液氮研磨法、缓冲液研磨法、烘干研磨法和直接研磨法这4种方法从高粱叶片中提取基因组DNA,然后,通过凝胶电泳、SSR分析和SRAP分析检测所提DNA的浓度和纯度。[结果]采用4种方法提取高粱基因组DNA时的产量相差不大;采用前2种方法提取的DNA降解少,纯度高,可进行有效的SRAP-PCR和SSR-PCR,但缓冲液研磨法的SRAP-PCR结果稍差;而采用后两种方法提取的DNA降解严重,纯度低,但可进行有效的SSR-PCR。[结论]采用4种方法均可在短时间内提取到足够几十次PCR反应的高粱基因组DNA,液氮研磨法和缓冲液研磨法所提取的DNA应用范围更大,而烘干研磨法和直接研磨法所提取的DNA只能用于对片段较小的目的DNA进行特异性PCR。 相似文献
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4种高梁基因组DNA快速提取方法的比较 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]寻找快速、简单、成本低的高粱基因组DNA提取方法。[方法]首先,分别使用液氮研磨法、缓冲液研磨法、烘干研磨法和直接研磨法这4种方法从高粱叶片中提取基因组DNA,然后,通过凝胶电泳、SSR分析和SRAP分析检测所提DNA的浓度和纯度。[结果]采用4种方法提取高粱基因组DNA时的产量相差不大;采用前2种方法提取的DNA降解少、纯度高,可进行有效的SRAP-PCR和SSR-PCR,但缓冲液研磨法的SRAP-PCR结果稍差;而采用后2种方法提取的DNA降解严重、纯度低,但可进行有效的SSR-PCR。[结论]采用4种方法均可在短时间内提取到足够几十次PCR反应的高粱基因组DNA,液氮研磨法和缓冲液研磨法所提取的DNA应用范围更大,而烘干研磨法和直接研磨法所提取的DNA只能用于对片段较小的目的DNA进行特异性PCR。 相似文献
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采用单因素试验分析和正交试验设计,研究超声波辅助提取菜用黄麻色素的工艺条件,用Fenton法测定菜用黄麻色素的抗氧化活性.结果表明:(1)影响色素提取的因素为料液比>超声频率>提取温度>提取时间;(2)提取的最佳条件为使用60∶40(V/V)的0.1%盐酸和95%乙醇作为提取剂,料液比1∶80(g.mL-1),超声频率为中频,提取时间30 min,提取温度为60℃;以此工艺条件提取色素的产率达25.04%;(3)该色素溶液还原力强,具有清除超氧阴离子自由基O2.-和.OH的活性,在色素浓度为0.20 g.L-1时,对超氧阴离子自由基O2.-的清除率为70.11%,对.OH的清除率为83%. 相似文献
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根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。 相似文献
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[目的]探索适合真菌基因组DNA提取的有效方法。[方法]以酵母茵（Hansenula sp.HS07A）和青霉菌（Penicillium sp.HS07）为供试菌株,分别采用煮沸裂解法、石英砂研磨法、研磨和反复研磨冻融法和化学改良法提取其基因组DNA,比较这4种方法的提取效果。[结果]化学改良法提取基因组DNA,除去了机械破壁过程,减少了机械力对DNA造成的破坏,运用阴离子去污剂SIB提取DNA安全、价廉,能有效、完整地提取高质量的基因组DNA,凝胶电泳条带清晰、无弥散,以此基因组DNA作为目的片段的PCR扩增模板,扩增效果优于改良前的方法,并且这种方法也适合多种真菌和细菌基因组DNA的提取。[结论]化学改良法是提取真菌基因组DNA的有效方法。 相似文献
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黄麻DNA提取与RAPD反应体系的建立 总被引：6，自引：0，他引：6
以假黄麻、假长果、越南圆果 (圆果种黄麻 )等为材料 ,研究了黄麻 DNA的提取方法以及对 RAPD分析的影响因素 ,包括模板浓度、Mg2 + 、d NTP、引物和 Taq酶等 ,建立了适于黄麻种质 RAPD分析的 PCR反应体系 .即在 2 5μL反应体积中 ,Tris- HCl(p H8.0 )、KCl、Mg Cl2 、d NTP、随机引物的浓度分别为 10 mmol· L-1、5 0mmol·L-1、2 .5 mmol· L-1、15 0 μmol· L-1、0 .2 μmol· L-1,并含有 30 - 60 ng DNA与 1.5 U Taq DNA聚合酶 .扩增程序为 :94℃预变性 5 min;然后 94℃ 30 s,37℃ 1.5 min,72℃ 1min,4 1个循环 ;最后 72℃延伸 7mi 相似文献