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为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。 相似文献
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为表达纯化出免疫原性良好的牛Inhibin pET32a-matpeptide重组蛋白质,本试验通过对菌液IPTG诱导时间、温度以及诱导浓度的摸索确定了蛋白诱导最佳表达条件,利用重组蛋白小量表达确定目的蛋白以可溶性或包涵体蛋白存在,重组蛋白大量表达纯化出大量目的蛋白,通过Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果表明：使用1MIPTG,18℃诱导表达18h可诱导表达出重组抑制素蛋白,经重组蛋白小量表达确定目的蛋白以可溶性形式存在,Western blog试验表明重组蛋白有较高的免疫原性。本试验诱导表达出可溶性、免疫原性较高的Inhibin pET32a-matpeptide重组蛋白质,为后续制备抗抑制素α亚基抗体奠定了基础。 相似文献
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《华北农学报》2021,36(2)
为获得Omiganan抗菌肽并研究其抑菌活性,根据Omiganan抗菌肽的一级结构(NH_2-ILRWPWWPWRRK-COOH),通过基因工程技术,参考大肠杆菌和毕赤酵母偏爱密码子原则,分别获得Omiganan核苷酸序列,再以Omiganan核苷酸序列为模板,设计特异性引物,通过PCR技术扩增Omiganan基因,分别与pET32a表达载体和pPIC9K连接构建pET32a-Omiganan原核表达载体和pPIC9K-Omiganan毕赤酵母表达载体,对含pET32a-Omiganan重组质粒的菌株分别采用IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度和自诱导方式表达获得Omiganan重组蛋白,对含pPIC9K-Omiganan毕赤酵母菌株采用1%甲醇诱导获得Omiganan抗菌肽。结果表明,自诱导14 h后Omiganan重组蛋白的表达量最高,IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度皆能诱导Omiganan重组蛋白的表达,但两者之间无显著差异。通过毕赤酵母表达的Omiganan抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很强的抑菌活性。 相似文献
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为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。 相似文献
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黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western-blot分析 总被引：2，自引：0，他引：2
为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pET-11a上,构建了融合表达的重组质粒pET/GO,转化E.coli BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS-PAGE电泳检测,GOD基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5 kDa.用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,Western-blot分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备奠定了基础. 相似文献
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自然条件下金丝桃素在植物中的含量较低且不稳定，提取工艺受其他物质的影响较大，在一定程度上限制了金丝桃紊在医药、食品等领域的应用。为了研究金丝桃紊合成途径并实现其体外转化，以贯叶连翘愈伤组织总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长eDNA，即Hyp基因。将该基因克隆到原核表达载体pET30a中，成功构建金丝桃索合成酶表达载体pET30a-Hyp，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。含有重组质粒的克隆在IPTG诱导下，表达出金丝桃素合成酶融合蛋白，利用Ni柱纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白，对纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果Hyp基因得到了高效表达，大小约为20kD。 相似文献
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克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。 相似文献
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棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达 总被引：1，自引：1，他引：0
目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。 相似文献
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人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。 相似文献
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旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。 相似文献
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为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。 相似文献
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为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。 相似文献
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础. 相似文献
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利用RT-PCR技术扩增得到瓜类黄化褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)上海市嘉定分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)。序列分析结果表明,cp基因的核苷酸序列长度为753 bp,编码250个氨基酸,与已报道的CCYV其他分离物的cp核苷酸相似性均高于95%。将此基因克隆到原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,CCYV cp在大肠杆菌中可表达出含有6-His标签的分子量约46 kDa的蛋白。纯化表达蛋白后免疫家兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示,制备的抗血清可用于检测田间感病样品中的CCYV。 相似文献
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马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。 相似文献
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黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能 相似文献
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为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。 相似文献