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1.
凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究 总被引：10，自引：1，他引：10
以凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌的ELISA技术。采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为106CFU·mL-1和1∶2000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达75.88%;交叉反应和阻断实验结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了30份人工感染后的凡纳滨对虾和健康凡纳滨对虾,阳性检测率分别为93.3%和13.3%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义。 相似文献
2.
分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。 相似文献
3.
从对虾养殖池中分离到1株细菌(编号2013042402,简称菌株02),分别用16S rDNA序列比对法和细菌全细胞脂肪酸气相色谱法对该菌进行鉴定.结果显示,菌株02为芽孢杆菌(Bacillus sp.).为探讨该芽孢杆菌在生物絮团对虾养殖中的使用效果,实验分别设置加菌加糖组(菌株02的量为2.0× 104 CFU/ml,蔗糖量为饵料的70％)、加菌组、加糖组(生物絮团组)及空白对照组,研究了菌株02对养殖水质(温度、盐度、溶氧、pH、氨氮及亚硝酸氮)、对虾存活率及水体中主要菌群组成等指标的影响.结果显示,加菌加糖组能显著降低养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮浓度,提高对虾存活率.生物絮团对虾养殖系统中添加菌株02,能够改善菌群结构,抑制弧菌生长.研究结果可为生物絮团对虾养殖中定向培养有益微生物提供技术支持. 相似文献
4.
自患病草鱼分离的类志贺邻单胞菌菌株LCCiL90625NA经甲醛灭活后注射新西兰大白兔,制备兔抗血清,Protein A亲和层析柱分离纯化抗体,通过优化反应条件,建立类志贺邻单胞菌间接ELISA检测方法.结果表明,制备的兔抗类志贺邻单胞菌多克隆抗体效价为1∶1.28×105,建立的ELISA检测方法可特异性地检测类志贺邻单胞菌,纯化后的多克隆抗体与副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、非O-1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、易损气单胞菌和杀鲑气单胞菌等细菌均无交叉反应,检测灵敏度为1.0×104 CFU·mL-1.该方法的建立为类志贺邻单胞菌的快速检测和该病的早期诊断及防控提供基础. 相似文献
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迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测法 总被引：8，自引：0，他引：8
以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)WY28作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1:2 048的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为-抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立迟缓爱德华氏菌的间接EIJSA快速检测法.采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106 CFU·mL-1和1:10 000;酶标二抗的最适工作浓度为1:1 000.病原菌检测灵敏度为每孔103 CFU.该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与肠杆菌科其他细菌参考菌株无交叉反应,具良好的特异性.对养殖场发病大菱鲆(Scophthalmus maximus)和半滑舌鳎中分离的细菌菌株进行检测,从56株分离菌株中检测出27株迟缓爱德华氏菌,阳性检出率为48.2%.该方法的建立有助于快速准确地诊断由迟缓爱德华氏菌引起的养殖鱼类病害. 相似文献
6.
高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验,饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区,来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征,并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506,其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低,饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高;②在门分类水平上,3组的变形菌门数均为最多,CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门,Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌,Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌;③稀释曲线和Shannon指数结果可见,CK组样品物种丰度和复杂度最低,且Bc组样品丰度和复杂度相对较高;④PCA分析发现,Rc组和CK组样品微生物组成较为接近,结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析,可见相较于荚膜红细菌,蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著,且益生效果更佳。研究表明,饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度,并能抑制弧菌属等有害菌群的生长,提高对虾体质量增加率并降低死亡率,从而达到益生效果,其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。 相似文献
7.
柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。 相似文献
8.
养殖水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465 对凡纳滨对虾抗病力的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
将蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)PC465添加到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖水体中至终浓度分别为10~4、10~5和10~6 CFU/mL,以无益生菌添加的养殖组为对照组,定期检测实验对虾肠道和养殖水体中的细菌总数、弧菌总数以及水体中氨氮含量和亚硝酸氮含量。实验结果表明,水体中添加益生菌能降低凡纳滨对虾肠道内细菌数量,且与对照组相比差异显著(P0.05);高浓度的益生菌处理组可以明显降低养殖水体内弧菌数量(P0.05),但是益生菌并没有显著影响水体中的氨氮含量和亚硝酸氮含量。养殖4周后进行WSSV投喂感染实验,感染实验表明,实验组H组(益生菌浓度为10~6 CFU/mL)和M组(益生菌浓度为10~5 CFU/mL)凡纳滨对虾的累计死亡率分别为63.9%和74.6%,显著低于对照组100%的累计死亡率(P0.05)。感染实验期间采用荧光定量PCR方法测定了凡纳滨对虾3种免疫相关基因的表达情况,统计数据显示,益生菌处理组的脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(lipopolysaccharide-β-1,3-glucan-binding protein,LGBP)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,βGBP-HDL)、热激蛋白70(heat shock proteins,Hsp70)mRNA的表达量在WSSV感染后呈显著上调趋势。实验结果提示,水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465可以提高凡纳滨对虾抗WSSV感染能力,其作用机制可能是降低对虾肠道和水体中的细菌和弧菌数量,或调节免疫相关基因的表达水平。 相似文献
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同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测. 相似文献
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采用ELISA、试管凝集、Western-blot等方法,分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V. paraheamolyticus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)等水产养殖中主要病原细菌与抗血清之间的免疫交叉反应.结果表明,弧菌属细菌之间的交叉反应程度比较大,而与其他两属的细菌之间存在的交叉反应程度小,或不存在交叉反应;Western-blot分析结果显示,哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌和副溶血弧菌抗血清分别与其他3种弧菌在分子量为135.6 kD和121.5 kD;95.6 kD,48.4 kD,39.2 kD和34.9 kD;55.1 kD的蛋白带处存在交叉反应,而这些分子量的蛋白带与其他两属的抗血清均不发生反应. 相似文献
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溶藻弧菌单克隆抗体的制备及应用 总被引：7，自引：0，他引：7
小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0与经溶藻弧菌(1.1587)免疫的BALB3/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合,有45.8%的培养孔有杂交瘤细胞生长,其培养上清液抗体阳性率为77.4%.经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞,获得7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3,AD1-F3,AD2-E7,AD2-F7.取AD1-F3扩大培养,注射小鼠,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水,滴度为11000.该腹水与其他3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应,与其他13株标准菌株无交叉反应.利用制备的单抗腹水,建立了检测溶藻弧菌的单抗-ELISA技术.该反应系统可应用于溶藻弧菌的快速诊断,反应时间为6-7h,检测灵敏度为104cells·-1.并利用该检测方法进行了11份待测菌样本溶藻弧菌的检测. 相似文献
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13.
A bacterium was isolated from the mid-gut of healthy black tiger shrimp, Penaeus monodon , based on a large zone of inhibition in mixed culture on solid medium. The isolate was a Gram-positive, motile spore former, with an optimum pH range for growth in tryptone soya broth containing 2% NaCl of between pH 6 and 9. The bacterium was highly salt tolerant with concentrations between 0% and 8% having no detrimental effect on growth. The isolate was identified as Bacillus pumilus based on physiological capabilities using the API50CHB and Biolog systems. Amplification and sequencing of the 16S rRNA gene followed by phylogenetic analysis confirmed its identity. The Bacillus pumilus isolate was strongly inhibitory against the marine bacterial pathogens Vibrio alginolyticus , V. mimicus and V. harveyi , and weakly inhibitory against V. parahaemolyticus in cross-streaking assays on solid medium. The organism was marginally self-inhibitory, and inhibited B. licheniformis and B. subtilis . The suitability of the B. pumilus isolate for use as a probiotic in farmed shrimp was further supported by the absence of any of the known B. cereus enterotoxin genes. Based on these in vitro results, in vivo safety and efficacy trials are underway to determine suitability of the novel strain as a commercial probiotic. 相似文献
14.
选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。 相似文献
15.
2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发 腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。 相似文献
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为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对三种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1:51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。综上所述,本研究制备的三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。 相似文献
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在基础饲料中添加不同配伍的坚强芽孢杆菌Bacillus firmus活菌（1.0×108CFU/g）、美人鱼发光杆菌Photobacterium damsela灭活菌（1%）和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus灭活菌（1%）作为实验饲料,基础饲料为对照组。实验所用凡纳滨对虾初始质量为3.2±0.26 g,投喂15d后进行WSSV感染实验并继续观察14d。实验期间定期取样测定对虾肠道胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性变化,并分析可培养肠道细菌总数和优势菌数量。结果表明,实验组对虾肠道中胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性整体水平均显著高于对照组（P<0.05）,肠道细菌数量较对照组有显著增加。其中,坚强芽孢杆菌与美人鱼发光杆菌灭活菌复合菌组具有最高的淀粉酶活性,坚强芽孢杆菌与溶藻弧菌灭活菌复合组具有最高的脂肪酶和胃蛋白酶活性,而坚强芽孢杆菌单一组具有最大的肠道细菌总数和优势菌数。本研究表明,饲料中添加潜在益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道消化酶活性并调节肠道菌群变化,利于养分的消化吸收。其中以坚强芽孢杆菌与美人鱼发光杆菌灭活菌复合组的整体效果较佳。 相似文献
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施氏鲟病原嗜水气单胞菌ELISA快速检测方法的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以施氏鲟(Acipenser schrenchii)细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测施氏鲟细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为107CFU/mL和1∶20000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达66.88%;交叉反应和阻断实验的结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了22份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟,阳性检测率分别为90.9%和13.6%,表明该技术不仅能够检测已发病的施氏鲟,而且能够检测带菌的施氏鲟。 相似文献
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罗非鱼源蜡样芽孢杆菌分离、鉴定及药敏特性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
从福建漳州某养殖场患出血病死亡的罗非鱼肝脏、肾脏及脾脏分离到一株致病性菌株FJLF。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及16S rRNA序列分子鉴定。生理生化特征和16S rRNA基因序列分析结果显示,分离到的FJLF株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状,且从病灶中分离到与原感染菌一致菌株。腹腔注射后该菌株对罗非鱼的半致死剂量LD_(50)=2.30×10~6CFU/g。FJLF株对诺氟沙星、头孢噻肟、新霉素及卡那霉素等8种抗生素高度敏感;对环丙沙星、痢特灵、红霉素及链霉素中度敏感;对苯唑西林、青霉素、头孢拉定及阿莫西林等10种抗生素耐药。 相似文献