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1.
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。 相似文献
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为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。 相似文献
3.
从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。 相似文献
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[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。 相似文献
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为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。 相似文献
6.
为获得大量猪α干扰素的重组蛋白,研究了其发酵条件,并对目的蛋白进行分离纯化。考察了不同IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L)、不同诱导温度(17、27、32、37℃)、不同诱导时间(0、2、3、4、5、6、7、8 h)对目的蛋白表达的影响;同时对包涵体进行提取、溶解变性进行研究,最后采用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。采用SDS-PAGE电泳及Image Pro Plus 6.0软件分析电泳结果,结果显示,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为27℃、诱导时间为6 h时,目的蛋白表达量最多;超声波破碎细菌的最优时长循环为10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵体过夜可得到大量可溶性目的蛋白含量,Ni柱亲和层析后可去除大量杂蛋白,获得较纯的目的蛋白。可见本试验通过优化重组猪α干扰素诱导表达条件及纯化方法,获得了高表达、高纯度的重组猪α干扰素蛋白,为今后研究其生物活性奠定了初步基础。 相似文献
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【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。 相似文献
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苦瓜核糖体失活蛋白MAP30(Momordica charantia antiviral protein 30)是苦瓜中一种具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性的蛋白质.将舍有重组表达质粒pET-28(a)-MAP30的大肠杆菌BL21进行诱导表达获得了重组蛋白MAP30,对IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导浓度、诱导时间表达条件的分析表明,工程菌经0.2mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h实现高效可溶性表达.利用镍离子鏊合亲和层析对重组蛋白纯化,当洗脱液中咪唑的浓度为100 mmol·L~(-1)时,目的蛋白被洗脱的效果最好.将纯化后的重组蛋白免疫家兔,获得了特异性的多克隆抗血清. 相似文献
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[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础. 相似文献
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采用PCR技术扩增TAT-H1bs融合基因,并通过基因操作构建了融合基因的原核重组载体pET-28a-TAT-Hlbs。将阳性重组质粒转化至受体菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western-blot检测。结果表明:重组菌能够表达目的蛋白,软件分析结果表明表达蛋白约占菌体蛋白的40%,上清表达量约为20%。上清蛋白经纯化后,Western-blot结果显示,His-Tag单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。所获得的融合蛋白以高效胞质可溶形式表达。 相似文献
12.
[目的]利用现代分子生物学技术探索蜡梅（Chimonanthus praecox）资源的药用价值。[方法]在有关蜡梅生物学特性研究基础上,构建蜡梅非特异性脂转移蛋白（nsLTP）基因家族4个成员（GenBank登录号：FJ889521、FJ904082、FJ904083、FJ904084）的原核表达载体CpLTP1-pET、CpLTP2-pET、CpLTP3-pET、CpLTP4-pET,并对诱导温度、IPTG浓度和诱导表达时间等条件进行了优化。[结果]在1.0mmol/L IPTG、37℃常规诱导条件下诱导6 h可获得高效表达,总表达产率可达到细菌全蛋白质总量的50%以上,包涵体表达远高于可溶性蛋白的表达;在0.5 mmol/L IPTG、28℃条件下诱导6 h能够获得较好的可溶性表达,利用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒获得4个纯化的重组蛋白。[结论]成功构建蜡梅nsLTP的原核表达载体,转化大肠杆菌Origami2（DE3）获得4个纯化的重组蛋白,可为后续的抗菌抗病毒活性研究提供研究材料,并为蜡梅资源药用价值的开发提供研究思路。 相似文献
13.
根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别. 相似文献
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本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达. 相似文献
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OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因（OjCHS）基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为：IPTG 浓度0.45 mmol·L-1,25 ℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究OjCHS的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。 相似文献
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[目的和方法]研究对不同诱导时间、诱导剂IPTG终浓度、培养温度和振荡培养箱转速等4个诱导培养条件对绵羊β_2-肾上腺素能受体(β_2-adrenoceptor,β_2-AR)第二细胞外环重组质粒pET32C-AR/Se在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响进行了研究,以筛选其最佳培养条件.[结果]随着IPTG诱导时间的延长,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量逐渐增加,在2 h时相对表达量达到最大值,为菌体总蛋白的30.1;.IPTG终浓度在0.01～2 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量水平均在27;～30;;当IPTG终浓度为0.01 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的30.5 ;.在设置的4个诱导温度中,25℃时重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的35.5;.在振荡培养箱不同转速条件下,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量在33;～40;波动;在200 r/min时,相对表达水平最高,为细菌总蛋白的40.0;.[结论]绵羊β_2-AR第二细胞外环基因在大肠杆菌中的表达最佳条件为:重组菌株在LB液体培养基中生长至OD_(600) 0.5左右时,加入IPTG至终浓度0.01 mmol/L,于25℃、200 r/min诱导120 min. 相似文献
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[目的]对 cry 基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据 NCBI 数据库信息设计引物序列,采用PCR 技术从抗虫棉基因组 DNA 中扩增出抗虫基因 cry 的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株中,利用 pGEX 原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同 IPTG 浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因 cry 的两段保守序列,长度分别为304 和 853 bp;SDSPAGE 检测结果显示,经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX4t1304 和 pGEX4t1853 成功地表达了大量 GST 融合蛋白,分子量分别为39 和 62.4 kDa,与预期结果一致;确定了 IPTG 最佳诱导浓度为 0.15 mmol/L,最佳诱导时间为 7 h。[结论]为今后检测转 Bt 基因农作物奠定了基础。 相似文献