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1.
通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。 相似文献
2.
将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,均表达出分子量为38 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰长耳兔5次,获得了SCMV-ⅠCP和SCMV-ⅣCP的多克隆抗体。间接ELISA结果表明,两种血清的效价均达到1∶8192。Western Blot结果表明,利用SCMV-ⅠCP制备的抗血清与DWK1反应更强,而利用SCMV-ⅣCP制备的抗血清与DWK2反应更强。本研究为SCMV检测及CP功能研究奠定了基础。 相似文献
3.
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑. 相似文献
4.
用葫芦[Lagenaria siceraria（Molina）Stand．]作为黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的繁殖寄主,通过差速离心和PEG二次沉淀法进行病毒提纯,用提纯病毒液免疫新西兰兔制备CGMMV抗血清。制备的CGMMV抗血清经间接ELISA法测定效价为1：5120;利用制备的抗血清检测田间样品,证明其可以用于CGMMV的血清学及免疫捕获RT—PCR检测。研究结果对今后开展葫芦科作物CGMMV检测,及时发现疫情以便采取防控措施,避免病毒扩散为害,确保葫芦科作物的安全生产具有重要意义。 相似文献
5.
《河北农业大学学报》2021,44(1):97-101
建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花的重要病毒。为对建兰花叶病毒广东分离物运动蛋白TGBp1进行研究,本试验制备了TGBp1多克隆抗血清,将CymMV广东分离物TGBp1基因克隆到原核表达载体中,诱导表达融合蛋白,以其为抗原制备多克隆抗血清,并对TGBp1进行生物信息学分析。结果表明,TGBp1融合蛋白的相对分子质量约为31.5 kD,该融合蛋白以包涵体形式存在;并以纯化的融合蛋白为抗原成功制备了TGBp1多克隆抗血清。Western blot分析表明,该抗血清与融合蛋白有较强的免疫反应;间接ELISA结果显示其效价高达524 288倍。生物信息学分析表明,该蛋白结构特征与已报道的CymMV其他分离物基本一致。本研究所制备的TGBp1多克隆抗血清具有专化性,为该蛋白质的生物学功能研究奠定了基础。 相似文献
6.
利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。 相似文献
7.
《山东农业科学》2017,(12)
以感染番木瓜环斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelon strain,PRSV-W)的西葫芦叶片为供试材料,通过RT-PCR克隆PRSV-W衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV上得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。将其转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后可表达分子量约为37 kD的融合蛋白。将融合蛋白从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰长耳兔,制备PRSV-W CP的抗血清。间接ELISA测定该血清效价为1∶8192。Western blot检测结果表明,该抗血清只与感染PRSV的西葫芦样品有特异性反应,而与健康西葫芦、感染西瓜花叶病毒的西葫芦及感染马铃薯Y病毒的普通烟样品均无反应。本研究为PRSV的快速检测以及CP蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
8.
《山东农业科学》2015,(8)
中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白(Coat protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连接到原核表达载体p EHISTEV,转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,表达出分子量均为19 k D的CP和CRP。将二者从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰大耳兔4次,获得了两种蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明,CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1∶4096和1∶2048。Western blot分析证明该抗血清只与感染CWMV的小麦有特异性反应,而与健康或感染小麦黄花叶病毒的小麦无反应。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增出CWMV RNA2全长片段,经T/A克隆连接到p MD18-T,获得质粒p MD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经XbaⅠ线性化后,利用T3 RNA聚合酶进行体外转录,转录产物摩擦接种本氏烟,15℃培养3天后,利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV CP蛋白。 相似文献
9.
采用RT-PCR方法扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,将其连接到原核表达载体pEHISTEV上,获得重组质粒pEHISTEV-PVY-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达出分子量为35 k D的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰大耳兔制备PVY CP抗血清。间接ELISA结果表明,该抗血清的效价为1∶16384,Western blot分析表明该抗血清只与感染PVY的普通烟植株有特异性反应,而与健康普通烟和感染PVX的普通烟植株无反应。本研究为PVY的血清学检测以及早期预警奠定了基础。 相似文献
10.
李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CPPNRSV,转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64 000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。 相似文献
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侵染丝瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒山东分离物分子鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
2013年,在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的丝瓜样品,利用该病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列(GenBank登录号:KJ187042)经NCBI BLAST比对,与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%,确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明,CGMMV山东丝瓜分离物(CGMMV-SDLoofah)与辽宁分离物(CGMMV-LN)等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组,从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。 相似文献
12.
为开发百合中南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)的血清学检测技术及研究ArMV的致病机理,原核表达ArMV衣壳蛋白(coat protein, CP),纯化并制备其多克隆抗体。以侵染东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)的ArMV基因组为模板,克隆ArMV CP基因全长,构建ArMV CP基因原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)原核表达ArMV CP蛋白,并以纯化ArMV CP蛋白为抗原制备兔抗多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明:克隆获得百合ArMV CP序列(GenBank登录号:MT323117)全长,其长度为1 515 bp,与已知的ArMV CP基因核苷酸序列相似性最高达到93.6%,氨基酸序列相似性最高达到98.2%;SDS-PAGE表明CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为56 ku; Western blot结果显示抗体能够特异性结合ArMV CP蛋白,具有良好的特异性。 相似文献
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用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。 相似文献
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从烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)感染的发病烟草叶片中提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到其运动蛋白基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上.DNA序列分析表明,所得运动蛋白基因全长为807 bp,与已报道的TMV-U1株系核苷酸和氨基酸同源性均为100%.将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导4 h后蛋白表达量达到最大,超声波显示所得融合蛋白以不可溶形式存在.SDS-PAGA检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,ELISA测定效价为25600,Western-blot检测证明在烟草叶片被侵染早期MP得到表达,且抗体特异性良好. 相似文献
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为获得特异性抗血清用于批量检测葡萄苗木中的葡萄卷叶伴随病毒3号(Grapevine leafroll associatedvirus 3,GLRaV-3),本研究用含有GLRaV-3CP蛋白基因的载体pMD18-CP为模板,PCR扩增CP蛋白基因。将PCR产物定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-G3CP。用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,GLRaV-3CP在大肠杆菌中得到高效表达。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。经分析,抗血清效价为1/214,试验结果显示,此抗血清能用于葡萄植株样品中GLRaV-3不同分离物检测。 相似文献
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小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测 总被引：1，自引：0，他引：1
用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。 相似文献
20.
根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒. 相似文献