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1.
猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究 总被引：2，自引：1，他引：1
提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1. 相似文献
2.
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 相似文献
3.
[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。 相似文献
4.
烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达 总被引：3，自引：3，他引：0
根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应. 相似文献
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利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F6代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各105.0TCID50,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。 相似文献
6.
草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备 总被引：1，自引：0，他引：1
PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。 相似文献
7.
《河南农业科学》2015,(12)
为制备抗延边白鹅IFN-γ蛋白的多克隆抗体,以已制备的pMD-IFN-γ质粒为模板,通过PCR扩增到延边白鹅IFN-γ基因,经TA克隆和BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将目的基因亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,将经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确的重组蛋白用GST标签纯化试剂盒纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行ELISA检测。结果显示,成功构建了原核表达载体p GEXIFN-γ,表达的重组蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为43 ku,制备的小鼠抗IFN-γ多克隆抗体效价为1∶16 000。 相似文献
8.
《新疆农业大学学报》2018,(4)
为制备马腺疫链球菌(Streptococcus equi subspecies equi)GAPDH蛋白的多克隆抗体,研究其免疫保护作用。以S.equi分离株为研究对象,利用PCR技术扩增其GAPDH基因并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌。诱导表达重组蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以纯化后的GAPDH重组蛋白免疫小鼠,用酶联免疫吸附法、攻击保护试验检测其免疫效果。结果显示,成功构建了pET-28a-GAPDH原核表达载体,纯化获得30 kDa重组蛋白。该蛋白质能特异性识别该菌抗血清,诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,在初次免疫后第45天,抗体水平效价可达1∶24 300,攻击保护率可达87.5%。该GAPDH重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。 相似文献
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为探明原核表达的重组猪IL-10对仔猪的免疫原性,根据GenBank公布的猪IL-10基因序列(登录号:L20001)设计并合成了扩增猪IL-10基因的引物。利用ConA刺激猪外周血淋巴细胞,通过RT-PCR扩增出pmIL-10完整基因及其成熟蛋白基因片段(pmIL-10),分别插入质粒pVAX1和pET32α(+),对猪IL-10基因进行原核与真核表达。利用纯化的重组蛋白免疫仔猪,制备抗血清,利用间接ELISA检测血清效价。将pVAX-pIL-10转染COS-7细胞,利用RT-PCR检测pmIL-10的转录,以间接免疫荧光(IFA)鉴定其与原核表达产物制备抗体之间的反应。结果显示:该试验成功获得了猪IL-10基因,重组菌pET-pmIL-10/Rosetta经IPTG诱导后,猪IL-10获得表达,目的蛋白表达量以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39.7%;以白油佐剂重组蛋白免疫仔猪可产生高水平的抗猪IL-10的抗体,经ELISA检测,P/N值可达到8,OD630吸光值可达1.875,该抗体与转染pVAX-pmIL-10的COS-7细胞发生明显的荧光反应,说明原核表达的重组猪IL-10免疫产生的抗体具有生物学活性,为日后利用猪IL-10抗体消除病毒感染中产生的内源性IL-10研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。 相似文献
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12.
为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 相似文献
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鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。 相似文献
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齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础. 相似文献
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创伤弧菌是导致鳗鲡产生体表溃疡死亡的重要致病菌。本研究克隆了创伤弧菌FJ03-X2株外膜蛋白基因(ompU),构建含该基因的原核表达载体,命名为pET-32a-ompU,将其转化到大肠杆菌E.coli中进行融合表达。37℃,0.5mmol.L-1的IPTG诱导4h,融合蛋白rompU以可溶形式表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的rompU为与预期大小一致的单一条带。将纯化的rompU免疫SD级大鼠,ELISA检测收获的多克隆抗体血清效价,并通过Western-blot证实该OmpU多克隆抗体可以识别创伤弧菌FJ03-X2株中的天然外膜蛋白OmpU。 相似文献
16.
利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。 相似文献
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【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。 相似文献
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将鸡IFN-α和IFN-γ原核表达产物经Ni2＋-NTA亲和层析法纯化,进行SDS-PAGE分析,再将纯化并已测定浓度的鸡重组IFN-α和IFN-γ稀释到1/10倍;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗新城疫病毒活性,并利用感染病毒的鸡胚来测定鸡重组表达蛋白的抗病毒活性。结果显示,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25kU左右的蛋白条带,纯化的鸡IFN-α和IFN-γ抗新城疫病毒复制的活性分别为4.32×103 U/mg和2.65×103 U/mg;当鸡IFN-α和IFN-γ的比例为125∶1时,其联合抗新城疫病毒复制的活性最佳。抗鸡胚感染病毒活性的测定结果表明,与病毒对照组相比,IFN-α和IFN-γ及IFN-α和γ联合组,HA滴度都有明显的降低;并且从鸡胚的平均死亡时间上,联合干扰素对新城疫病毒的抑制作用更强于单个干扰素的应用。这证明了鸡IFN-α、IFN-γ及其联合干扰素对新城疫病毒的复制有明显的抑制作用。 相似文献
19.
《江苏农业学报》2017,(2)
为了探讨原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白对于坦布苏病毒感染的免疫保护作用,利用IPTG诱导重组大肠杆菌表达坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白,Anti-FLAG M2 Affinity Gel纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白仅有单一目的条带。免疫组小鼠血清ELISA效价均达4.67±0.11(lg10)。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠体质量在攻毒9 d后高于对照组,荧光定量RT-PCR检测结果显示,攻毒后免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏组织中坦布苏病毒核酸含量均低于对照组。表明使用原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白免疫可诱导产生高水平抗体,并提供良好的免疫保护力,为开发有效的坦布苏病毒亚单位疫苗提供依据。 相似文献
20.
《福建农业学报》2019,(9)
【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2 048 000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。 相似文献