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利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 总被引：3，自引：0，他引：3
为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株.高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库.对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上. 相似文献
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枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。 相似文献
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用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库 总被引：1，自引：0，他引：1
为筛选枯草芽孢杆菌EDR4拮抗相关基因,利用转座子TnYLB-1构建该菌株的插入突变体库。通过对种子液OD600值、转接培养液Ⅰ继续培养OD600值及转接培养液Ⅱ后的孵育时间3因素设计正交试验,转化过程中加入pMarA质粒的不同量及质粒与感受态细胞共培养的不同时间研究2因素对转化效率的影响,确定pMarA对EDR4的转化体系。通过50℃高温诱导培养产生EDR4的插入突变体,挑取单菌落2 756个,构建EDR4的插入突变体库,随机挑选14株突变体经PCR检测转座子TnYLB-1序列,发现转座子已成功插入到EDR4基因组中;进一步通过Southern杂交验证,发现转座子TnYLB-1主要以单拷贝形式随机插入,也有部分多拷贝插入。此突变体库的建立可为以后筛选该菌株拮抗相关基因等研究奠定基础。 相似文献
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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2能有效的防治棉花黄萎病,同时还具有降解蛋黄卵磷脂的能力。将含有mini Tn10转座子的pHV1249质粒电击转入NCD-2菌株中,51℃高温诱导转座子插入突变,构建了NCD-2菌株的解磷突变子库,筛选到3株丧失解磷能力的突变子。运用染色体步移技术对突变株M216中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和序列分析,结果表明丧失解磷能力突变株中转座子插入基因与B.subtilis 168菌株中PhoR基因的相似率达到98%,Southern杂交验证突变株中转座子为单拷贝插入。将PhoR基因克隆到pHY300PLK质粒上构建重组质粒电击转化M216进行功能互补验证,互补菌株部分恢复了解磷能力,表明NCD 2菌株中PhoR基因与其降解卵磷脂能力具有相关性。 相似文献
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利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础. 相似文献
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[目的]从沙门氏菌全基因组范围筛选和鉴定其与β-内酰胺类抗生素耐药性相关的基因.[方法]对临床分离的10株沙门氏菌进行药敏试验,选择耐药性最广泛的菌株作为研究对象,利用mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,筛选文库中对β-内酰胺类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]从突变株文库中筛选得到15株分别对青霉素G、氨苄西林和头孢哌酮敏感的突变株,其中3株对三种抗生素都敏感.转座子破坏基因为STM4216 (inner membrane protein)和STM4150 (50S ribosomal protein L1).[结论]筛选出的基因有望成为控制或扭转沙门氏菌耐药性的作用靶点. 相似文献
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为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感突变株中被转座子破坏的基因包括ecs4206(磷酸核酮糖激酶)、ecs3959(β-D-半乳糖苷酶β亚基)、ecs3946(假定蛋白)和ecs1857(DNA结合转录调控因子)。筛选出的基因可被开发为控制或扭转大肠杆菌耐药性的作用靶点。 相似文献
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为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。 相似文献
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【目的】敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6中的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(C23O),构建其Tn5插入突变体,为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础。【方法】以构建好的3G7Tn5突变体菌株为基础,借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶,将转座子Tn5从菌株3G7中电击转化至4F6,消除pKD46质粒,敲除4F6菌株中的C23O基因,测定出发菌株3G7、4F6及Tn5插入突变体菌株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5间位苯环的裂解活性。【结果】42℃条件下消除了Tn5插入突变体受体菌4F6中的pKD46质粒,构建了4F6-G9和4F6-H5突变体。Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5的间位苯环裂解活性无显著差异;菌株4F6的间位苯环裂解活性虽明显高于菌株3G7,但也仅有1个C23O基因,其活性差异可能与布洛芬降解调控因子有关。【结论】提供了一种简便有效定位并敲除C23O基因的方法。 相似文献
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【目的】筛选苯酚化合物相关降解微生物,确定其相关功能特性,为进一步揭示相关降解机制以及开发利用该菌株提供科学依据和基础。【方法】以苯酚为筛选压力对盐爪爪根际微生物进行分离筛选,采用16S rDNA序列测序确定相关降解菌的生物学地位,并对其抗逆特性和功能特性进行分析,开展其对苯酚和玉米赤霉烯酮降解的研究。【结果】获得了一株编号YZZ-9的菌株,经鉴定该菌为沼泽考克氏菌(Kocuria palustris),其能够在10%的NaCl,3.5 g/L的苯酚下生长良好,且能利用多种苯类化合物为单一碳源生长。当培养基中苯酚浓度低于1.0 g/L时,苯酚可在120 h内完全降解;当苯酚浓度达到1.5 g/L,培养基中的苯酚降解几乎完全被抑制。同时,菌株可明显降解玉米赤霉烯酮,当菌株培养144 h时,培养基中玉米赤霉烯酮降解率可达68.9%。【结论】菌株YZZ-9具有良好的苯酚和玉米赤霉烯酮降解能力。 相似文献
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短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01转座突变株的构建及转化体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
Tn5转座子及其衍生载体被广泛应用于革兰氏阴性菌的基因功能研究,但尚未见有利用Tn5转座子导入革兰氏阳性菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01菌株的报道.本研究通过构建Tn5转座载体,对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的突变株.同时,考察了感受态细胞培养浓度、电击电压、电... 相似文献
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以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10~(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。 相似文献
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【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。 相似文献
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为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。 相似文献
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转座子标签法是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术,是一种利用TEs插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离TEs插入的旁邻序列,克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物的功能基因组学研究中十分有用。玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统三大类。其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10~(-5)~10~(-4),比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由Mutator转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法,对相关的突变基因进行克隆。当前通过这种方法,已经克隆出一些重要的基因。本文主要介绍了Mutator转座子的应用,并对Mutator转座子系统的研究前景进行了展望。 相似文献