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感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础. 相似文献
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为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。 相似文献
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用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础. 相似文献
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WRKY转录因子在植物生长发育及逆境调控过程发挥着重要作用。前期通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆cDNA文库时发现GmWRKY52(NP＿001237726.2)可能与GmNF-YA13蛋白存在互作，为明确二者是否存在互作，本研究克隆GmWRKY52基因并进行生物信息学分析，利用酵母双杂交系统鉴定GmWRKY52和GmNF-YA13之间的互作关系。结果显示：GmWRKY52基因全长1 163 bp,编码1个由265个氨基酸组成的蛋白质，多序列比对和系统发育树分析结果说明GmWRKY52基因与野生大豆GsWRKY69(XP＿028186817.1)亲缘关系较近。酵母双杂交结果表明GmWRKY52和GmNF-YA13蛋白不存在相互作用。研究结果说明GmWRKY52与GmNF-YA13蛋白在酵母细胞内并不发生互作。 相似文献
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为了进一步解析小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A的调控机制，本研究对其进行了自激活性检测。利用已构建好的小麦酵母cDNA文库，以TaNRT1.1-1A为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白，回转试验进一步验证其互作关系。结果表明，TaNRT1.1-1A无自激活活性，酵母双杂技术筛选小麦cDNA文库，共获得2个候选互作蛋白，候选蛋白Sdr I-like主要参与植物病害有关的应答响应。Sdr I-like的回转验证结果表明，该蛋白可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。该结果可为进一步研究TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。 相似文献
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OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测 总被引：1，自引：1，他引：0
采用PCR技术扩增水稻（Oryza sativa L）根UV-B敏感基因1（ROOT UV-B SENSITIVE 1,RUS1）四个不同片段[OsRUS1（1-1782）、OsRUS1（1-504）、OsRUS1（510-1282）、OsRUS1（1188-1782）],连接到T载体pMD18-T-Simple上,测序无误后分别亚克隆到诱饵载体pGBKT7上,酶切和测序结果表明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体构建成功,读码框正确;转化重组载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD-Trp-DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明诱饵载体对酵母菌株Y187没有转录激活活性和毒害作用。说明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白奠定了基础。 相似文献
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由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。 相似文献
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植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×106 CFU,转化效率为9.15×105 CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×108/mL,文库滴度为2.22×107CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。 相似文献
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利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段. 相似文献
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小麦土传花叶病毒病是侵染小麦的一种重要病害,该病害病原有多个病毒种类,主要为小麦黄花叶病毒（WYMV）和中国小麦花叶病毒（CWMV）,由禾谷多黏菌以持久性方式传播为害。为明确该病害在山东的最新分布状况,于2013-2016年采用田间调查,结合dot-ELISA和RT-PCR检测等方法对小麦土传花叶病毒病进行了研究。结果表明,小麦土传花叶病毒病主要分布在鲁南地区,而鲁中、鲁东、鲁北等为零星发生区。WYMV主要分布在临沂、济宁、泰安和枣庄等地;CWMV主要分布在烟台、威海、青岛、临沂和德州等地;烟台、威海、青岛、临沂为两种病毒的混发区。对CWMV主要分布区域（文登、荣成、胶州、莒南、平原、沂水、福山）的CWMV的CP基因进行系统进化聚类分析发现,CWMV的CP基因同源性为94.7%～98.3%,在进化树中聚类为两组,其中,平原、文登、福山和莒南分离物与日本分离物（登录号：AB299272.1）亲缘关系较近,沂水、荣成和胶州分离物与江苏大丰分离物（登录号：EF121374.1）亲缘关系较近。 相似文献
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Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) is a recognized member of the genus Fijivirus,family Reoviridae.Its genome has ten double-stranded RNA (dsRNA) segments (S1-S10),in which the fifth genome segment (S5) contains two open reading frames (ORFs) with a partially overlapping region.The second ORF of RBSDV S5 encodes a viral nonstructural protein named p5b with unknown function.To reveal the function of p5b,its gene was ligated into the bait plasmid pGBKT7 and an expression library containing rice cDNAs was constructed using plasmid pGADT7 for yeast two-hybrid assay.The bait protein p5b was detected in yeast by western blot,and the result of an auto-activation test showed that p5b could not autonomously activate the expression of reporter genes in yeast.Then the bait protein p5b was used for screening the cDNA expression libraries of rice.Gene fragments of some pivotal enzymes involved in photosynthesis,respiration and other important metabolic processes,were identified to interact with p5b in yeast,suggesting that these interactions may play roles in symptom development in infected plants. 相似文献
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转WYMV-Nib8基因抗黄花叶病小麦的鉴定及优良株系的选育 总被引：3，自引：0，他引：3
小麦黄花叶病是我国冬麦区亟待解决的重要病害之一。为了给应用病毒复制酶基因介导的转基因抗病小麦新品种（系）选育提供依据，对利用基因枪法将WYMV-Nib8基因和bar基因共转化扬麦158获得的15个T2代株系进行了黄花叶病抗性鉴定，筛选出4个高抗病株系和1个剔除bar基因的高抗病株系；连续多年抗病性鉴定结果表明，通过转基因技术获得的5个株系不但抗病性优良而且可以稳定遗传。以转基因材料为亲本之一，通过常规杂交、回交获得1个兼抗小麦黄花叶病和白粉病且农艺性状优良的新品系BR1014。 相似文献
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酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白 总被引：1，自引：0，他引：1
RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。 相似文献