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从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)野生型菌株YBT-9602基因组中通过PCR扩增到编码一种具有细胞壁锚定活性的芽胞皮层水解酶的编码基因mbA。序列测定和编码产物结构域预测分析显示,mbA编码产物在结构上由1个具有肽聚糖结合性能的N-末端结构域和1个具细胞壁水解酶活性的C-末端结构域组成,具有作为细胞表面展示系统的运载蛋白的潜力。通过体外构建mbA与绿色荧光蛋白基因gfp的融合基因(mbA-gfp)并导入苏云金芽胞杆菌受体菌中进行表达,经对重组菌全细胞免疫荧光显微镜观测、蛋白酶pronase消化试验和SDS处理,证实GFP被成功展示于受体菌细胞表面;经流式细胞仪测定,以细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶为靶蛋白的表面展示系统有42.97%的重组菌细胞可展示融合酶,重组菌具有13.5U/mL的全细胞酶活性。结果表明,MbA作为一种细胞壁锚定蛋白可用于构建新的苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统。 相似文献
2.
[目的]克隆和表达嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,用其构建能承载外源抗原表位的乳酸菌细胞表面展示系统。[方法]以染色体DNA为模板克隆S-层蛋白基因SlpA,通过酶切、连接将其插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et,构建表面展示系统pW425et-S,并对酶切位点进行分析。[结果]将pW425et-S转化入thyA基因缺陷型E.coli X13感受态细胞,SDS-PAGE、Western-blotting、全细胞ELISA检测表明,在重组菌表面表达出S-层蛋白,构建出表面展示系统,确定BstEⅡ作为融合外源保护性抗原基因的酶切位点。[结论]克隆出嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,成功构建表面展示系统pW425et-S,为开发乳酸菌活载体口服活菌疫苗提供了可行性操作平台。 相似文献
3.
低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值，然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多，对其基因多样性了解不够深入，因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源，通过基因组序列比对分析，从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测，表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度，同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp，预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质，氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃，在0 ℃相对酶活为60.2%，是一个低温脂肪酶；其最适pH为8.5，在pH 3.0~12.0时，仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后，PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB)；在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中，吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识，所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶，具有较好的应用前景。 相似文献
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[目的]对热纤梭菌内切葡聚糖酶进行酿酒酵母细胞表面展示研究,探索降低纤维素酶成本和提高酶活的方法。[方法]通过提取产内切葡聚糖酶的热纤梭菌总DNA,根据热纤梭菌内切葡聚糖酶基因序列和酿酒酵母表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,克隆内切葡聚糖酶目的基因,将其连接到酵母表面展示质粒载体pYD1上,构建重组质粒pYD1-CelA,并将其转化入酿酒酵母菌株EBY100中,经诱导表达后,测定表达产物的最适温度和pH,并分析影响其活性的金属离子种类和浓度。[结果]PCR扩增获得1 400bp左右的内切葡聚糖酶CelA基因片段,并成功构建了该基因与酵母表面展示质粒载体pYD1的重组质粒pYD1-CelA。重组质粒转化酿酒酵母菌株EBY100后,在鉴定培养基上测定透明圈的大小得出最佳诱导时间为60 h。表达产物性质的研究结果显示其最适反应温度为50℃,在pH 4.6时酶活性相对较高。[结论]该研究结果为后续对纤维素酶的进一步研究、改造、大量生产及应用奠定了一定的基础。 相似文献
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《农业环境科学学报》2006,(14)
通过An815与带EGFP标记的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa/EGFP)原生质体电融合,得到一株融合子R2,该融合子不仅具有An815菌高效降解蒽的能力,而且具有铜绿假单胞菌产生生物表面活性剂的能力,在72 h内将蒽从100 mg.L-1降解至27.9 mg.L-1,降解能力比出发菌An815提高了22%。 相似文献
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木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。 相似文献
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纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性.本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100％.将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101.采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35％,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异. 相似文献
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通过An815与带EGFP标记的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa/EGFP)原生质体电融合,得到一株融合子R2,该融合子不仅具有An815菌高效降解蒽的能力,而且具有铜绿假单胞菌产生生物表面活性剂的能力,在72 h内将蒽从100 mg.L-1降解至27.9 mg.L-1,降解能力比出发菌An815提高了22%。 相似文献
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[目的]为降低L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产成本提供依据。[方法]通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109成熟区的L-天冬酰胺酶II基因(ansB),将扩增片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-asp。对pMD18-T-asp与质粒pET-22b进行双酶切后,将它们连接起来,转化感受态细胞,筛选重组表达载体pET-22b-asp。利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3),并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究。[结果]成功克隆长度为960 bp的L-天冬酰胺酶II基因。重组表达载体pET-22b-asp也构建成功,并在BL21中得到表达。在重组菌接入TB培养基后2 h加入IPTG、培养基的初始pH值为7.2、装液量为12%,L-天冬酰胺酶Ⅱ酶活最高。重组天冬酰胺酶的纯化收率为82%,比活力达196 U/mg。[结论]重组天冬酰胺酶的胞外表达大大简化了其分离步骤。 相似文献
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在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性，即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段，本文构建了解离载体pBMB5401，并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401，分别得到重组质粒pBMBcaiiA，pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922，重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组，消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR，BMB3aiiAR和BMB3439R，在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达，具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力，当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。 相似文献
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施氏假单胞菌YC-YH1对甲基对硫磷的降解及其代谢产物检测 总被引：1，自引：0，他引：1
利用实验室已获取的菌株YC-YH1对甲基对硫磷进行降解,以高效液相色谱结合质谱分析(HPLC-MS)测定菌株YC-YH1对甲基对硫磷的降解速率并检测其代谢产物,通过基因克隆研究菌株YC-YH1对甲基对硫磷降解的分子机制,同时分析代谢产物对菌株YC-YH1生长的影响.结果表明,菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),能够高效降解甲基对硫磷,其同时含有甲基对硫磷水解酶基因mpd和有机磷水解酶基因ophC2.经质谱分析确定,菌株YC-YH1将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚和二甲基硫代硫酸酯,其中对硝基苯酚显著抑制YC-YH1的生长.综上,施氏假单胞菌YC-YH1能够高效地降解甲基对硫磷,但对硝基苯酚作为其代谢产物对YC-YH1的生长存在显著抑制作用. 相似文献
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有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%~65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%~77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。 相似文献
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有机磷化合物在农业生产中作为杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成大面积的污染.本研究在烟草中表达细菌来源的有机磷降解酶基因ophc2,将有机磷降解酶分泌到植物体外,希望通过植物根系降解环境中的农药残留.构建了植物表达载体,包含CaMV 35S启动子序列、extensin序列、有机磷降解酶编码基因ophc2和nos终止子序列,命名为pBI-E-opphc2.胡萝卜extensin 基因的信号肽序列引导ophc2基因表达产物分泌到胞外.经过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）,共获得101株转化植株,PCR检测证实有80株含有目的基因片段.从80株中随机挑选60株经western杂交检测,有24株呈阳性.酶活性测定实验结果表明,转基因植株可以释放有机磷降解酶到培养基中,并且具有有机磷水解酶活性.对于转基因植物降解培养介质中和吸入植株中的有机磷农药的实际效果将在以后报道. 相似文献
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人工养殖大鲵病原荧光假单胞菌的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从四川洪雅人工养殖的患病大鲵(Andrias davidianus)肝、肾中分离到一株优势菌(S100814),以腹腔注射、浸泡的方式进行人工感染试验,证实其为养殖大鲵的病原菌.该分离株生理生化特性与荧光假单胞菌一致,该菌为革兰氏阴性短杆菌,在TSA平板上生长呈边缘整齐、半透明的圆形灰白色菌落.接触酶、精氨酸双水解酶、... 相似文献
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Phosphatidylinositol has been identified as a major component of the ice nucleating site on the outer surface of two bacteria, Pseudomonas syringae and Erwinia herbicola. Plant lectins binding to inositol and a highly purified phosphatidylinositol-specific hydrolase (a C(II) lipase) inhibited or decreased the efficiency of the ice nucleating activity (INA) of both bacteria. Extracts of these two INA(+) bacteria had phosphatidylinositol synthase activity while extracts from related INA(-) Pseudomonas or Erwinia strains had no detectable synthase activity. An Escherichia coli strain acquired phosphatidylinositol synthase activity when transformed to the INA(+) phenotype with recombinant plasmids containing fragments of P. syringae DNA. 相似文献
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Amplification of an esterase gene is responsible for insecticide resistance in a California Culex mosquito 总被引：21，自引：0，他引：21
C Mouchès N Pasteur J B Bergé O Hyrien M Raymond B R de Saint Vincent M de Silvestri G P Georghiou 《Science (New York, N.Y.)》1986,233(4765):778-780
An esterase gene from the mosquito Culex quinquefasciatus that is responsible for resistance to a variety of organophosphorus (OP) insecticides was cloned in lambda gt11 phage. This gene was used to investigate the genetic mechanism of the high production of the esterase B1 it encodes in OP-resistant Culex quinquefasciatus Say (Tem-R strain) from California. Adults of the Tem-R strain were found to possess at least 250 times more copies of the gene than adults of a susceptible strain (S-Lab). The finding that selection by pesticides may result in the amplification of genes encoding detoxifying enzymes in whole, normally developed, reproducing insects emphasizes the biological importance of this mechanism and opens new areas of investigation in pesticide resistance management. 相似文献
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采用细胞破碎、硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-75凝胶过滤的方法,对黑曲霉(Aspergillus niger)J6产生的有机磷农药降解酶进行分离和纯化,并对其酶学性质进行研究。结果显示:黑曲霉J6有机磷农药降解酶定位在细胞膜上,其分子量为66 000。该降解酶最适pH值为7.0,最适反应温度为70℃,Fe3+、Cu2+、Li+、Zn2+、Mg2+、NaN3、EDTA、SDS、PSMF对该降解酶有不同程度的激活作用,而Mn2+对其有轻微的抑制作用,Ca2+和Triton对其有强烈的抑制作用。 相似文献
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为研制新型微生态制剂,从试验小鼠中分离出1株肠道酵母菌,采用形态学、生理生化、基因测序和系统发育树分析等方法对其进行鉴定。结果显示,该菌菌落呈白色、圆形,在显微镜下细胞呈椭圆形,出芽生殖;该菌能发酵葡萄糖、蔗糖和D–甘露醇,能够同化蛋白胨和硝酸钾,不能耐受高浓度乙醇,脲酶试验结果为阴性。序列分析结果表明,该菌株18SrDNA(登录号为KC534843)与汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)18SrDNA(登录号为AB013567)的同源性达99%,26SrDNA(登录号为KC534842)与汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)26SrDNA(登录号为EU131182)的同源性达99%。系统发育树分析结果显示,该菌株18SrDNA与Debaryomyces hansenii(登录号为AB013590)的亲缘关系最近,26SrDNA与Debaryomyces hansenii(登录号为EU131182)的亲缘关系最近。由以上结果可推断该菌为汉逊德巴利酵母。 相似文献
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