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1.
ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。 相似文献
2.
【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。 相似文献
3.
依据RNA干扰机制构建多病毒基因靶向的RNA干涉双元载体系统,为培育抗病毒复合侵染的番茄品种提供遗传转化载体。以烟草病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)病毒外壳蛋白基因作为RNA干扰靶标基因,针对病毒株系间外壳蛋白基因同源区域设计靶序列引物,经RT-PCR获得两段靶标基因的DNA靶序列。借助T载体将两段靶序列连接成一条DNA序列。酶切后正向、反向锚定连接到p UCCRNAi中间载体的克隆位点,形成靶序列在载体中的双向重复结构;重复结构酶切后插入含超强启动子的p C2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒电击转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成RNAi双元载体系统的构建。 相似文献
4.
目的 构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体.方法 应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定.用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxAE 1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达.结果 基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功.DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平.结论 成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体. 相似文献
5.
利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。 相似文献
6.
西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。 相似文献
7.
目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。 相似文献
8.
松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究 总被引：2，自引：0，他引：2
克隆了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段,构建大量表达松材线虫RNA聚合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体,并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰实验。结果表明,松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为73.2;对照处理的繁殖倍数为322.8,两者的繁殖倍数相差4.4倍;松材线虫浸泡在4℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为120.8。RNA聚合酶基因的双链RNA(dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖;并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验,双链RNA(dsRNA)20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。 相似文献
9.
禽呼肠孤病毒σC基因是病毒粘附蛋白,σNS基因具有结合单链RNA活性。根据siRNA靶序列设计原则,设计并合成siRNA模板并克隆到shRNA表达载体pSilencer-CMV 4.1 neo。分别构建了针对σC基因的shRNA载体C1、C2、C3和针对σNS基因的shRNA载体NS1、NS2、NS3。将构建的shRNA载体和阴性对照分别与表达σC和σNS基因的融合蛋白的真核表达载体pEGFP-σC及pEGFP-σNS共转染DF-1细胞。荧光显微镜观察结果表明,6个shRNA片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Real-time PCR检测结果表明,C3和NS1体外干扰病毒复制的效果最佳。 相似文献
10.
【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。 相似文献
11.
不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析 总被引：2，自引：0，他引：2
禽流感病毒（AIV）在高免疫压力情况下会发生变异而逃避免疫系统的监视。其NS1蛋白共有230个氨基酸,其中前73个氨基酸残基以二聚体形式存在,包含了所有RNA的结合活性。NS1的氨基端1—73位是mRNA的结合区,氨基端1—100位是双股RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的结合区。PKR抗病毒作用机制如下：病毒侵染宿主细胞时,在宿主干扰素的诱导下,双股RNA与PKR结合,同时真核翻译启动子α亚单位发生磷酸化,导致PKR的激活。激活的PKR能同时抑制宿主细胞和病毒mRNA的翻译,从而最终抑制入侵病毒在细胞中的有效繁殖和扩散。 相似文献
12.
通过常规的基因克隆技术，对香蕉束顶病毒NS株系代表分离物的DNA组分6进行了克隆和序列分析，并将该分离物这个组分的序列与先前报道的广州天河分离物（属NSP株系）的该组分序列进行比较，结果表明：该组分全序列，ORF及其编码的氨基酸序列在2个分离物间的变异率分别为3.4%,17%t 2.6%,表明该组分在2个株系代表分离物间存在较显著差异，从而进一步支持了广东BBTV存在2个株系的结论，此外，NS株系代表分离物DNA组分6的全序列，ORF及其编码的氨基酸序列与澳大利亚分离物的变异率分别为14．4％，7．5％和7．1％。 相似文献
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猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。 相似文献
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Evolution of human influenza A viruses over 50 years: rapid, uniform rate of change in NS gene 总被引：34，自引：0，他引：34
D A Buonagurio S Nakada J D Parvin M Krystal P Palese W M Fitch 《Science (New York, N.Y.)》1986,232(4753):980-982
Variation in influenza A viruses was examined by comparison of nucleotide sequences of the NS gene (890 bases) of 15 human viruses isolated over 53 years (1933 to 1985). Changes in the genes accumulate with time, and an evolutionary tree based on the maximum parsimony method can be constructed. The evolutionary rate is approximately 2 X 10(-3) substitution per site per year in the NS genes, which is about 10(6) times the evolutionary rate of germline genes in mammals. This uniform and rapid rate of evolution in the NS gene is a good molecular clock and is compatible with the hypothesis that positive selection is operating on the hemagglutinin (or perhaps some other viral genes) to preserve random mutations in the NS gene. 相似文献
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以A型流感病毒NP基因为靶标,设计并合成了3对编码发夹状siRNA寡聚核苷酸。将合成的序列互补的寡聚核苷酸退火形成双链,克隆至pSilencer 1.0-U6载体中,并转化DH5a菌株,氨苄抗性筛选阳性菌落,扩大培养后,提取质粒进行酶切鉴定,并进行测序分析。结果显示,酶切后得到预期长度的DNA片段;插入序列插入的位置与设计完全一致,无碱基缺失或突变。表明A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体构建成功。 相似文献
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采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。 相似文献
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根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因序列,设计合成了1对特异性引物,扩增出病毒ORF3结构基因。将该基因克隆到pMD18-T,构建了重组质粒pMD18-ORF3,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的ORF3基因组全长812 bp。通过DNAman对所测ORF3基因核苷酸序列与GenBank中登录的国内外PRRSV毒株核苷酸序列进行同源性比较。序列分析结果显示,XJPRRSV1/03与参考毒株VR2332、LV、CH-1a的核苷酸同源性分别为95.8%,89.8%,92.7%,氨基酸同源性分别为96.6%,88.5%,93.2%。XJPRRSV1/03与VR2332同源性最高。 相似文献
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网状内皮组织增殖病病毒（REV）不同分离株LTR基因的序列分析 总被引：9，自引：0，他引：9
从山东，江苏的几个大型鸡场收集疑为REV感染的鸡脾脏，肝脏，提取组织DNA，并以此为模板，通过PCR技术，从山东泰安及江苏海安的某鸡场中分别扩增到REV的LTR基因，将该基因克隆进TA载体中，转化大肠杆菌TG1，经酶切鉴定，得到了两株REV LTR基因的克隆，标记为SD和HA，所将得克隆测序并与国外报道的REVLTR基因进行比较，发现国内分离株与国外株有94％以上的同源性。 相似文献