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1.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2019,(2)
【目的】由可侵染单子叶植物和双子叶植物的病毒Foxtail mosaic virus (FoMV)构建病毒表达载体。【方法】通过在病毒3’端非编码区插入Potato virus X (PVX)病毒的启动子PVXprom和外源基因序列构建病毒表达载体。【结果】构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP,该载体能在本氏烟接种叶中表达GFP绿色荧光蛋白。【结论】成功构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP。 相似文献
2.
【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一,严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性,为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样,提取总RNA,利用TMGMV特异检测引物确认阳性后,设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列,通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上,获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性,利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒,经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果,测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt,编码4个功能蛋白,分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白C... 相似文献
3.
以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3~5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。 相似文献
4.
《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2020,(4)
【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体，并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列，将其克隆至原核表达载体pET-28a中，转化到BL21（DE3）表达菌，经IPTG诱导后，对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔，从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列，将其克隆至植物表达载体pBI111L中，再转化到农杆菌GV3101中，利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1 T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列，成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体，实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达（包涵体）。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列，成功构建了pBI111LP-PRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体，用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54 ku的蛋白，该蛋白在prl1点突变体中表达量下降，在PRL1 T-DNA插入突变体中缺失，而在prl1回复株系中表达量升高，并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体，可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。 相似文献
5.
【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO（AF347695）同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11%—100.00%,后者侵染率为63.16%—90.00%,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异。 相似文献
6.
【目的】通过分析发现木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）C4开放阅读框（open reading frame,ORF）附近可编码3个不同大小的蛋白,而NCBI数据库登录的CLCuMuV各个分离物编码的C4蛋白大小也不尽相同,本研究试图通过分析该3个假定的“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响,以明确CLCuMuV C4蛋白ORF的确切定位。【方法】根据双生病毒编码蛋白的保守性,在CLCuMuV C4 ORF附近查找到3个大小不等的ORF,分别标记为C4-L（567 nt）、C4-M（546 nt）和C4-S（303 nt）。利用同源重组的方法将该3个ORF分别构建到PVX异源表达载体,通过农杆菌介导的植物接种法,分析PVX介导的3个蛋白在本氏烟表达对本氏烟症状的影响。利用同源重组的方法构建CLCuMuV野生型及C4-L或C4-S缺失突变型的侵染性克隆,同样通过农杆菌介导的植物接种法,分别与其伴随DNA-β分子的侵染性克隆接种本氏烟,分析C4-L或C4-S缺失对CLCuMuV致病性的影响,并利用Southern blot和Western blot分别对接种烟草的病毒基因组的积累量和病毒C4蛋白的表达量进行分析。同时利用Gateway系统载体对C4-L和C4-S蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位进行分析。【结果】PVX异源表达载体接种本氏烟,结果发现PVX-C4-L和PVX-C4-S接种的本氏烟叶片卷曲、叶柄伸长,并且PVX-C4-S症状更重,而PVX-C4-M接种的本氏烟症状较轻或基本无症状,Western blot试验也在PVX-C4-L和PVX-C4-S接种组检测到了C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白对PVX异源病毒的致病性影响最大。侵染性克隆接种本氏烟,结果发现野生型（CLCuMuV）和C4-L突变型（CLCuMuV-ΔL）接种的本氏烟叶片皱缩增生、叶柄和茎秆扭曲,而C4-S突变型（CLCuMuV-ΔS）和对照组（Mock）接种的本氏烟未显示任何症状,并且前两者的植株高度明显矮于后两者,同时Southern blot试验在CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接种的本氏烟中均检测到大量病毒基因组的积累,而Western blot试验也在其中检测到C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白在CLCuMuV诱导寄主产生症状过程中起关键作用。亚细胞定位发现YFP-C4-L主要定位在本氏烟叶片表皮细胞的叶绿体,YFP-C4-S则定位在细胞膜或细胞质周边,并有点状聚集体结构。【结论】C4-S ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染必不可少,而C4-L和C4-M ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染不是必需。 相似文献
7.
利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus,CLBV）中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上,以CLBV中国分离物（CLBV-HBYD）全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY,该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定（GenBank登录号：MG572236）,其基因组全长8 747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％-98％,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6 软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。 相似文献
8.
【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体)。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。 相似文献
9.
《宁夏农林科技》2021,(2)
【目的】本项研究旨在通过建立一个异源VIGS体系,为枸杞重要性状相关基因的功能鉴定提供前期信息。【方法】从枸杞叶片中克隆获得409 bp长的八氢番茄红素脱饱和酶基因(phytoene desaturase, PDS)的编码区片段,构建入基于烟草脆裂病毒的VIGS空载体中,通过农杆菌介导的侵润接种,将重组的病毒沉默载体p TRV2-PDS转入本氏烟中。【结果】本氏烟幼苗被侵染接种后,沉默处理植株的叶片呈现整叶白化的表型,而阴性对照植株叶片一直未出现变白的症状,q RT-PCR检测表明,接种17 d后,与阴性对照植株相比,沉默处理植株PDS基因的表达显著地被抑制(P0.05),说明枸杞PDS基因的同源基因在本氏烟中得到了有效沉默。【结论】该VIGS体系的构建,可用于对枸杞部分基因功能的快速初步鉴定和筛选,旨在提高枸杞基因功能研究的效率。 相似文献
10.
【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。 相似文献
11.
【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一,严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类,探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性,为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品,提取样品总RNA,利用小RNA深度测序初步探明病毒种类,然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段,然后通过同源重组克隆到pCB301双元载体上,得到YoMV-GD分离物基因组全长序列,同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟,检验pCB301-YoMV-GD的侵染性,然后再注射接种萝卜和菜心,测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3（Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3）、萝卜黄病毒1（Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种;YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt,编码4个蛋白,分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP,与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高,为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近;构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟,引起严重的坏死、枯斑等症状,具有较强的侵染性;YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心,引起轻微的黄化和花叶等症状,致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV,且以复合侵染形式存在;YoMV遗传进化并没有明显的地域性;YoMV-GD对烟草致病力较强,而对萝卜和菜心致病力较弱。 相似文献
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【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。 相似文献
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【目的】明确引起广东棉花曲叶病的病原,为该病害的防控提供理论依据。【方法】应用PCR、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)、基因克隆及测序等技术获得病毒分离物GD01基因组及卫星分子的序列,并对序列进行分析;通过构建GD01及其β卫星分子的侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β和利用农杆菌介导的注射接种方法,测定GD01及其β卫星分子对棉花的致病性;进一步通过Southern blot检测对接种植株进行分析与验证。【结果】侵染广东棉花的病毒分离物GD01基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 737nt,且与在中国发现的木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V)第一个分离物朱槿分离物G6序列相似性为100%。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 345 nt,与G6伴随的β卫星分子(Cotton leaf curl Multan betasatellite isolate G6,CLCu Mu B-[G6])序列相似性为99.9%。构建了GD01 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β,农杆菌注射接种本氏烟,接种后15 d,二者混合接种的本氏烟植株新出的叶片表现明显的皱缩、卷曲等症状;随着时间的推移,本氏烟的症状越来越明显。农杆菌注射接种棉花,接种后30 d,二者混合接种的棉花植株新出叶片开始出现叶脉变深绿色,叶片卷曲等症状;接种后90 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为叶片向上卷曲、叶脉深绿色、叶脉肿大等典型棉花曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的棉花植株没有产生明显的症状。Southern blot检测结果显示,表现典型曲叶症状的接种棉花植株均含有GD01 DNA-A及其β卫星分子,进一步支持这些症状是由GD01 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起。【结论】病毒分离物GD01 DNA-A及其伴随的β卫星分子与入侵中国的CLCu Mu V第一个分离物朱槿分离物G6相同,CLCu Mu V-[GD01]及其伴随的CLCu Mu B-[GD01]复合侵染引起广东棉花曲叶病,利用农杆菌介导的侵染性克隆接种法,完成了CLCu Mu V及其CLCu Mu B复合侵染引起棉花曲叶病的柯赫氏法则(Koch's Postulates)。 相似文献
14.
【目的】分析致病疫霉（Phytophthora infestans）NLP（Necrosis- and ethylene-inducing like proteins）家族基因PITG_10839的致坏死功能及所编码蛋白的活性位点对其功能的影响。【方法】以PITG_10839作为研究对象,选inf1作为正对照,以致病疫霉菌株HK09-19的总RNA为模板,通过RT-PCR获得基因的cDNA全长序列。将所得cDNA与表达载体pBI121连接,构建所选基因的重组表达载体,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在本生烟（Nicotiana benthamiana）中对PITG_10839的表达和功能进行分析。利用over-lap PCR方法定点突变基因PITG_10839的活性位点,同时构建活性位点突变后的重组表达质粒,并通过农杆菌注射接种本生烟来研究各活性位点在基因坏死功能中所起的作用。通过荧光定量PCR分析致病疫霉游动孢子侵染马铃薯叶片后不同时期PITG_10839的表达模式。【结果】获得了PITG_10839和inf1的全长cDNA,分别为405及357 nt。同时,成功构建了PITG_10839和inf1的真核表达载体pBI121-10839和pBI121-inf1,并成功转入农杆菌。将含有重组质粒pBI121-10839的农杆菌注射接种本生烟,5 d后接种叶片开始逐渐黄化,7 d后叶片出现典型的皱缩坏死症状。然而含有对照重组质粒pBI121-inf1的农杆菌在注射接种3 d后,本生烟叶片便开始出现萎蔫,5 d时则出现坏死症状,7 d时坏死症状严重。进一步对PITG_10839编码蛋白的活性位点进行突变,发现D9A、E22A和D20A 3个氨基酸位点的突变使基因PITG_10839所编码蛋白的致坏死功能丧失,叶片仅出现轻微的黄化现象,然而H17A位点氨基酸的突变对该基因的致坏死功能没有影响,注射接种7 d后,仍然可以使本生烟叶片出现皱缩坏死的症状。同时,荧光定量PCR表明,致病疫霉游动孢子接种后不同侵染阶段PITG_10839的表达呈现出了不同水平的增加。接种后12 h至36 h,表达量变化水平稳定,增加了20倍左右;48 h时其表达量急剧上升至350倍左右;随后表达量开始下降,但仍高于接种36 h时的表达水平。【结论】致病疫霉NLP家族基因PITG_10839具有致使烟草叶片坏死的功能,并确定了影响该基因所编码蛋白致坏死功能的氨基酸活性位点。 相似文献
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【目的】以水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）编码的NSvc4蛋白和CP蛋白的致病功能鉴定为切入点,研究RSV的致病机理。【方法】通过农杆菌介导在本氏烟中对RSV编码的6个蛋白进行细胞定位。采用双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）技术鉴定NSvc4蛋白与其余5个蛋白间的互作关系,并用酵母双杂交体系（Yeast two-hybrid,YTH）对NSvc4与CP蛋白间的互作再次验证。利用马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）系统在本氏烟叶片研究NSvc4蛋白和CP蛋白的致病性,采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术验证致病性鉴定结果。【结果】RSV NSvc4蛋白能与CP蛋白互作,且蛋白复合体在本氏烟细胞中能够定位到叶绿体。致病性鉴定显示,PVX-RSV-NSvc4侵染的本氏烟表现为花叶症状;PVX-RSV-CP能够在侵染叶上诱导花叶症状,但是系统叶却恢复健康;PVX-RSV-NSvc4与PVX-RSV-CP共侵染的本氏烟和PVX-RSV-NSvc4CP侵染的本氏烟的侵染叶、系统叶均表现出了严重病症。Real-time PCR结果显示,PVX载体在各侵染本氏烟中的累积量均较低,而RSV CP和NSvc4基因的表达量与本氏烟的发病症状紧密相关。【结论】NSvc4和CP蛋白均有致病性。CP蛋白的致病力不能持久,但是与NSvc4蛋白互作后具有持久致病力,表明二者协同在RSV致病过程中发挥作用。 相似文献
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【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element,HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element,LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。 相似文献
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【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。 相似文献
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【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。 相似文献