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1.
山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白.应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体.重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白.结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmo|·L-1 IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku).结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件. 相似文献
2.
以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。 相似文献
3.
以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础. 相似文献
4.
在获得凋亡蛋白融合基因重组质粒pMD18-T-EGF-PⅡ-Apoptin的基础上,成功地构建了重组表达质粒pET-28a-EGF-PⅡ-Apoptin,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,结果表明,表达蛋白带位于33 kD处,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的40%.表达蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,对獭兔进行常规免疫,应用ELISA检测到较高的多克隆抗体效价,表明此蛋白具有良好的抗原性.Westem blot结果显示,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合. 相似文献
5.
CTB-CPA融合基因构建、表达及其产物的免疫原性 总被引：3，自引：0，他引：3
构建成含有编码霍乱毒素B亚单位 (CTB)和产气荚膜梭菌α毒素 (CPA)第 70～ 370位氨基酸的融合基因CTB CPA ,并在大肠杆菌中获得表达。经限制性内切酶鉴定和核苷酸序列分析表明 ,CPA基因在重组质粒中与CTB基因的连接向位是正确的 ,位于CTB基因的下游并与CTB基因处于同一阅读框架。重组菌株BL2 1(DE3) (pECTB CPA)经IPTG诱导后 ,其表达产物经SDS PAGE和Western blot检测表明 ,重组菌株可以表达CTB CPA融合蛋白。表达的产物以包涵体的形式存在 ,可分别被抗CT和A型产气荚膜梭菌抗毒素识别 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 7%。用表达产物免疫小鼠后 ,所产生的对A型产气荚膜梭菌毒素攻击的免疫保护力高于用单独的A型产气荚膜梭菌类毒素免疫的小鼠所产生的免疫力 ,证明所表达的融合蛋白中CTB起到免疫佐剂的作用 ,增强CPA的免疫原性 相似文献
6.
伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物. 相似文献
7.
通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::stx1A-LHRH,将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中。对重组菌株用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明重组菌株表达出了23700的目的融合蛋白Stx1A-LHRH,目的蛋白为包涵体表达,经薄层扫描分析表明表达量约占菌体总蛋白的37.6%。为了将来更好的进行目的蛋白的功能研究,本研究再将融合基因片段克隆到表达质粒pMAL-p2x中实现了重组蛋白的可溶性表达,表达的重组蛋白经amylose亲和层析柱一步纯化后纯度可达93.4%,为下一步进行重组蛋白的活性分析及其生物学作用研究奠定了基础。 相似文献
8.
通过RT．PCR法获得阿克苏（Akesu／O／58）FMDV结构蛋白基因vp1，将该基因克隆到pGEM．TEasy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438，构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinFMDV-vP1。结果表明：vp1基因为639bp。重组中间表达载体pBinVP1经BamHI／Sal I双酶切、PCR扩增和序列测定，表明vp1基因、Kozak序列等插入pBinVP1中。在含50mg／L卡那霉素、25mg／L链霉素和50mg／L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行vp1基因的PCR检测，证明植物双元表达载体pBinFMDV-vP1构建正确。 相似文献
9.
大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR方法，从肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因组DNA中，分别扩增出Stx1B和Stx2B亚基的结构基因片段，然后再通过PCR将这2个片段连接起来，并定向克隆到表达质粒pET28a的Nco1和EcoR 1位点之间，构建了重组表达质粒pMB1。将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中，对重组菌株BL21(pMB1)用IPTG进行诱导表达，并对最佳诱导时间进行了探索。SDS-PAGE电泳检测结果表明。重组菌株表达出了16300的目的蛋白Stx2B-L-Stx1B；经薄层扫描分析表明，表达量约占菌体总蛋白的68．4％，且目的蛋白为包涵体表达，表达量约占细菌沉淀的84．6％。研究还表明，未用IPTG诱导的BL21(pMB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明，在3～7h的诱导时间内，目的蛋白的表达量没有明显变化。 相似文献
10.
为了获得安全性好,对出血性大肠杆菌具有良好免疫保护作用的疫苗株,本实验以构建的O157△ler/stx基因缺失突变株为载体,将决定特异性粘附的eae全基因插入到质粒pBR322∷stx1/2B中,构建了基因工程菌O157△ler/stx(pBR322∷stx1/2B∷eae),对该基因工程菌进行生物学特性分析,实验结果表明,该菌正常培养可表达eae;具有粘附HEp-2细胞的特性;该菌培养上清对Vero细胞没有毒性作用;给小鼠口服接种该工程菌后可在肠道中定居至少10 d;14日龄小鼠口服活菌量为5×109CFU/只,小鼠生长正常,没有出现任何临床症状;该菌通过口服免疫小鼠可以诱导肠道粘膜免疫应答和体液免疫应答.这些结果表明,该工程菌安全性好,免疫原性强,是有价值的预防EHEC O157感染的基因工程疫苗候选株. 相似文献
11.
新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
12.
To augment the immunogenicity of the subunit B of Shiga toxin (Stx2e B) produced by Escherichia coli and protect piglets from edema disease in china, a fusion gene was constructed consisting of Stx2e B genetically linked at the N-terminus of the B subunit of heat-labile enterotoxin (LTB) in a translational fusion. After being induced with IPTG, the expressed fusion protein of Stx2e B-LTB was about 8.8% of total proteins, approximately 13 microg/ml of the bacteria culture. The Stx2e B-LTB fusion protein was found to be nontoxic to Vero cells at the dose higher than 1 microg/ml and to mice less than 100 microg/ml. Antibody titer against the fusion protein Stx2e B-LTB was 1:76,800, much higher than that of the recombinant Stx2e B protein (1:12,800) alone. All of the mice immunized with the Stx2e B-LTB fusion protein survived when challenged with a lethal dose (LD) of Stx2e toxin. The results showed that the poor immunogenicity of Stx2e B was overcome by conjugating the stx2e B to ltB. The immunogenicity of the constructed fusion protein Stx2e B-LTB in the present study was highly qualified to protect animals against Shiga toxin produced from Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). The fusion protein of Stx2e B-LTB could be a candidate for a vaccine against edema disease and post-weaning diarrhea simultaneously in piglets. 相似文献
13.
基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位B/C抗原区和A/D抗原区,根据GeneBank中猪瘟病毒B/C基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增猪瘟病毒B/C基因。将扩增所得猪瘟病毒B/C基因克隆于PMD18-T载体,然后定向亚克隆猪瘟病毒B/C基因至原核表达载体PET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有B/C基因的重组质粒命名为PETB/C。用PETB/C转化受体菌BL21,挑取单个菌落,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实B/C基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG,诱导6h其表达达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组B/C蛋白具有反应活性,大小约为9KD。用表达产物作ELISA,结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应,而与其它8种疫病阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。通过对58份送检血清样品的检测结果显示其与Dot-ELISA的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原,为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。 相似文献
14.
试验旨在构建微小隐孢子虫表面抗原CP15基因原核表达载体并获得重组CP15蛋白。试验以已知重组质粒pMD-CP15为模板,PCR方法扩增出CP15基因片段,并亚克隆到pGEX4T-3,构建了在E.coli BL21中GST融合表达载体pGEX-CP15;经1 mmol/L IPTG进行诱导表达获得目的蛋白,其大小采用SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定。结果表明,扩增出约390 bp的微小隐孢子虫表面抗原CP15基因片段并成功构建pGEX-CP15质粒,表达出分子质量为42 ku的融合蛋白,与推导的理论值相符。Western blotting显示该蛋白能被GST血清识别。牛微小隐孢子虫表面抗原CP15基因在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。 相似文献
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根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性. 相似文献
17.
根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。 相似文献
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利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。 相似文献
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美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
对原核中以包涵体形式高效表达的美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段进行了变性、复性与纯化研究。将美洲型PRRSV重组质粒pGEX-6P-1-N转化入E.coliBL21(DE3)细胞中,成功表达了重组蛋白GST-N,超声裂解复性后目的蛋白经GSTrap FF纯化试剂盒纯化后,纯度可达90%以上。将欧洲型PRRSV重组质粒PQE30-N转化入E.coliM15细胞中表达了重组蛋白His-N。超声裂解后目的蛋白经HisTrapHP蛋白纯化试剂盒纯化后,纯度可达95%以上。Western blot结果表明,两种蛋白分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清识别。纯化出的大量美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段,为PRRSV的鉴别诊断提供了抗原基础。 相似文献