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1.
MaWRKY1是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能,制备了MaWRKY1多克隆抗体。选取MaWRKY1基因全长中N端第168 ~ 400个氨基酸之间的包括两个WRKYGQK保守域的cDNA序列,构建了原核表达载体pET-MaWRKY1,并转化到大肠杆菌BL21中诱导表达菌体蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果表明,His-MaWRKY1融合蛋白成功获得了高效表达,分子量在26 kD左右。His-MaWRKY1融合蛋白经过Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5 mg • mL-1。经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清,采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA）和蛋白质印迹（Western blot）分析,表明所制备的抗体具有很好的效价,效价比为1︰160 000,同时具有良好的灵敏度和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白,Western blot检测显示,在分子量26 kD左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗体可以与香蕉WRKY蛋白特异性结合,并且低温可以诱导香蕉果实中MaWRKY1蛋白表达,暗示MaWRKY1蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。 相似文献
2.
以黄瓜果实总RNA为模板,通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序列,进行测序,构建T-easy载体。SMART在线预测CsKF1和CsKF2均含有动蛋白（Kinesin）约340个氨基酸残基的马达区保守序列（moter domain）。体外表达蛋白的马达区和非马达区,将带有His标签的CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M融合蛋白通过E. coli BL21（DE3）表达,摸索不同诱导条件下目的蛋白的表达和纯化。其中His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M原核表达蛋白的分子量分别为25、30和40 kD,均以0.1 mmol · L-1 IPTG,22 ℃ 6 h诱导表达效果最好。His-CsKF2-M原核表达蛋白的分子量约38 kD,以18 ℃ 8 h诱导表达效果最好。融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C经过亲和纯化后作为抗原,通过5轮免疫注射兔子后,取心脏血作为抗血清,通过AminoLink Plus kit试剂盒亲和纯化得到多克隆抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C。经过Western blot分析表明多克隆抗体具有特异性,可与抗原特异结合。 相似文献
3.
采用RT-PCR和RACE技术,从刺梨（Rosa roxburghii Tratt）果实中扩增出GDP-L–半乳糖磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase,GGP）基因的全长cDNA序列,并分析其在不同组织和果实不同发育阶段的表达特点及其与AsA积累的关系。结果表明：刺梨GGP基因cDNA（RrGGP,GenBank 登录号：HM998753）包含1个长度为1 341 bp的开放阅读框（ORF）,编码445个氨基酸;其氨基酸序列与苹果、猕猴桃等的相似性均在80%以上。RT-PCR分析表明,该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实中的表达量最强,叶中次之,而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都能检测到RrGGP的表达,在发育初期（花后50 d内）表达较弱,花后60 ~ 100 d呈高水平表达,而后随着果实成熟而下调。刺梨中RrGGP的表达特点与AsA积累高度一致,意味着该基因可能是果实发育过程中AsA合成的关键基因。 相似文献
4.
以‘浏阳金柑’为研究材料,克隆到2个UDP–鼠李糖合成酶（UDP-Rhamnose synthase,RHM）基因FcRHM1和FcRHM2的全长。FcRHM1的开放阅读框（ORF）长度为2 007 bp,编码668个氨基酸,分子量为75.3 kD;FcRHM2的ORF长度为2 031 bp,编码676个氨基酸,分子量为76.2 kD。多序列比对显示,FcRHM与其他植物的RHM蛋白序列高度相似。亚细胞定位显示FcRHM1和FcRHM2定位于细胞质和细胞核。原核表达及体外酶促反应结果显示,FcRHM1和FcRHM2均可将UDP–葡萄糖转化为UDP–鼠李糖。组织特异性表达显示,FcRHM1和FcRHM2在不同组织中表达量存在一定的差异。结合UDP–鼠李糖的积累模式,认为FcRHM1和FcRHM2可能都参与了UDP–鼠李糖的合成,但FcRHM1对于花和果实中UDP–鼠李糖的合成更为关键,而FcRHM2则主要负责叶片及芽的UDP–鼠李糖的合成。 相似文献
5.
桃叶片β- 半乳糖苷酶基因全长cDNA克隆及原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用RT-PCR和RACE技术, 从蟠桃(Amygdalus persica var. compressa Bean) 中克隆出3 285 bp的β - 半乳糖苷酶基因cDNA全长, GenBank登录号为AY874412。该cDNA 2 559 bp, 编码853个氨基酸。将其插入到大肠杆菌表达载体pET-32a ( + ) 中, 转化BL21 trxB (DE3) , 筛选重组菌株。经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE呈现约115 kDa特异表达条带。并通过体外酶促反应分析表达的融合蛋白的生物活性。 相似文献
6.
以‘度尾文旦柚’正常果和果顶部开裂（3个等级）果实为材料,取果顶部的果皮进行转录组测序,筛选到与裂果具有潜在联系的基因。裂果果皮中半乳糖醛酸转移酶（催化聚半乳糖醛酸合成）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（维持细胞壁结构）基因表达量显著降低,果胶降解酶类（聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶）基因表达量显著提高,这些基因表达量的变化可能引起细胞壁机械力度降低,从而导致裂果。3–酮脂酰–CoA合成酶（催化蜡质成分中长链脂肪酸合成的酶）基因在正常果果皮中的表达量是裂果的5倍～6倍,裂果果皮中该基因表达量的降低可能引起果皮抗蒸腾能力减弱,导致果皮部位水分亏缺,甚至细胞凋亡及裂隙形成。高温和水分亏缺逆境响应基因（编码脱水响应元件结合蛋白、类钙调磷酸酶酶B亚基互作蛋白激酶、WRKY30、WRKY33和WRKY40）在裂果果皮中表达量均显著降低,表明高温和水分亏缺与裂果相关。 相似文献
7.
从罗汉果（Siraitia grosvenorii）转录组中获得一条与罗汉果甜苷Ⅴ生物合成相关的葡萄糖基转移酶（UDPG）的unigene片段,以罗汉果授粉后70 d的果实RNA为模板,利用RACE和RT-PCR技术克隆UDPG全长基因,将克隆得到的SgUDPG1基因连接到原核表达载体pEASY-E1上,构建融合表达载体,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,重组蛋白纯化,SDS-PAGE检测表达产物以及Western-blotting和质谱鉴定蛋白产物。结果表明,获得了1条SgUDPG1,全长为1 959 bp,开放阅读框ORF为1 365 bp,编码1条454 aa的肽链,理论分子量为51.2 kD,等电点为5.39,具有植物中次生代谢产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG-box motif。SgUDPG1在授粉后50 d和70 d的果实中表达逐渐升高,是对照授粉后3 d的5.16倍和13.12倍,与果实中甜苷Ⅴ含量呈相同趋势。此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达,并且可以纯化出比理论分子量大5.3 kD的融合蛋白,通过Western-blotting和质谱鉴定,确定该蛋白属于罗汉果葡萄糖基转移酶。 相似文献
8.
利用RT-PCR和RACE技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白基因cDNA全序列,将其命名为PaGAI。该基因cDNA全长2 310 bp,开放阅读框ORF为1 788 bp,推测其编码一个含有595个氨基酸残基的多肽链,蛋白质分子量约64 kD。生物信息学分析结果表明,PaGAI编码蛋白具有DELLA蛋白保守结构域,其N端存在两个非常保守的酸性结构域DELLA和VHYNP作为信号感知区域,C端有VHIID、RVER 和SAW结构域作为阻遏区域。PaGAI与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdRGL2b蛋白同源性最高,达到84%。构建pGEX-4T-1/PaGAI原核表达体系,并转化E. coli BL21,经0.5 mmol · L-1 IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测获得了分子质量为91 kD的融合蛋白,半定量RT-PCR分析表明,PaGAI在花、果实、叶片、韧皮部中普遍表达,在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。 相似文献
9.
为了探讨草莓中单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase,MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）基因的功能,采用同源克隆的方法从‘丰香’草莓中克隆得到cDNA全长序列,并采用实时定量PCR方法对其在不同组织和不同发育阶段果实中的表达模式进行分析。结果表明：草莓MDHAR基因cDNA（FaMDHAR,GenBank登录号：KP025946）全长1 305 bp,编码434个氨基酸,分子量约为47 kD,含有保守的FAD结合结构域,定位于细胞质中。GR基因cDNA（FaGR,GenBank登录号：JQ339738）开放阅读框全长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为53 kD,定位于细胞质中。FaMDHAR在各组织中均有表达,在成熟果实中表达量最高,叶和花次之,根中最低;在果实发育过程中FaMDHAR在绿果期有相对较高的表达,随后急剧增加,到白熟期最高,之后下降并维持在相对稳定水平。FaGR在叶和花中表达较高,在成熟果实中较低;在果实发育过程中,表达量从小绿期呈现增加趋势,至转红果期达最高,随后逐渐下降,在成熟果实中较低。果实发育过程中酶活性变化呈现出与各自基因表达量相似的变化规律。经过4 ℃低温处理24 h后的草莓叶片中,FaMDHAR相对表达量较对照显著增加,而FaGR无显著变化。草莓中FaMDHAR和FaGR表达存在时空差异,并对低温逆境响应存在差异。 相似文献
10.
阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试
材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L - 1 IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min- 1 ·mg- 1。 相似文献
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从■(Prunus salicina Lindl.var.cordataJ.Y.Zhang et al.)成熟叶片均一化全长cDNA文库中新分离得到了1个PPO基因,命名为PsPPO2,基因登录号为JF681036.1。经NCBI-BLAST分析,其核苷酸序列与蔷薇科果树中的河北鸭梨和富士苹果果实的PPO基因具有很高的同源性,分别为81%和80%;与作者先前分离克隆的PsPPO1和PsPPO3基因同源性分别为55%和56%,说明此克隆是PPO基因家族的新成员。通过RT-PCR分析,PsPPO1、PsPPO2和PsPPO这3个基因在■不同生长发育时期和果实受损伤后的表达模式。在叶片发育过程中,PsPPO2表达量都很高;PsPPO1在嫩芽和幼叶中表达;PsPPO3只在嫩芽中表达;在果实发育的不同时期,PsPPO2和PsPPO3在早期表达,随着果实成熟表达量下降,PsPPO1在褐变果中表达量较高。受机械损伤后,PsPPO1受诱导,而PsPPO2和PsPPO3不受诱导。 相似文献
12.
枇杷果实DHN基因克隆及其在低温胁迫下的表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
以白沙枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）‘宁海白’幼果为试材,通过RT-PCR与RACE扩增,获得两个具有脱水素基因典型结构域特征的cDNA序列。其中DHN1（GenBank登录号：FJ472835）全长639 bp,编码188个氨基酸,属于Y2SK3类型;DHN2（GenBank登录号：FJ472836）全长858 bp,编码273个氨基酸,属于SK3类型。用低温胁迫处理枇杷幼果,–3 ℃处理24 h后电导率明显升高,表明细胞膜开始受到破坏,–6 ℃处理24 h后电导率显著高于–3 ℃处理。半定量RT-PCR和Western-blotting分析结果表明这两个DHN基因在低温胁迫下的枇杷幼果中都上调表达,表明其与枇杷抗低温胁迫有一定关系。 相似文献
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草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。 相似文献
14.
根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。 相似文献
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藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析 总被引：4，自引：0，他引：4
以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。 相似文献
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冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据植物乙烯受体ETR1家族氨基酸和核苷酸的保守区序列设计简并引物, 通过RT2PCR从半红期冬枣果实中分离了两个1 058 bp的乙烯受体cDNA片段。在分析已知序列基础上, 分别通过3′RACE及对两个基因上游5′端编码区的扩增, 得到了两个包含完整开放阅读框(ORF) 以及3′端非编码区( 3′UTR) 的乙烯受体编码基因, 即ZjETR1和ZjERS1。它们分别编码738个和632个氨基酸。这两个编码基因的氨基酸与其它植物乙烯受体氨基酸高度同源, 分别属于ETR1亚类和ERS1亚类乙烯受体。 相似文献
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酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）是一个保守的蛋白家族,在酰基酯辅酶A的转运过程中发挥重要作用。在水稻和拟南芥中鉴定的ACBP除了参与长链酰基辅酶A的转运以外,还参与了植物对生物和非生物胁迫的反应。为了探讨在苹果树中是否也存在参与植物对逆境反应的ACBP,并可用于改良苹果品种,以提高抗逆能力,从苹果品种‘鸡冠’中克隆、鉴定了一个ACBP基因,命名为MdACBP2。MdACBP2包含一个378 bp的开放阅读框,编码包含125个氨基酸残基的蛋白质;推定的氨基酸序列中包含有一个ACB结构域,无信号肽序列。序列和结构特征表明该基因是ACBP家族ClassⅠ亚族的成员。利用荧光定量PCR技术检测MdACBP2的表达,发现在苹果的根、叶、花、幼果、枝皮、芽等组织中均有表达,在叶中的表达量最高,在幼果中的表达量最低,这一表达模式暗示MdACBP2可能参与多种生理途径。不同胁迫处理的时序表达分析表明,MdACBP2的表达能被轮纹病病原菌Botryosphaeria dothidea侵染和10% PEG渗透胁迫所抑制,低温胁迫则能诱导MdACBP2的表达,1 mmol·L-1 Pb(NO3)2处理对MdACBP2的表达没有显著影响。推测MdACBP2可能参与了苹果对低温胁迫的防御反应。 相似文献
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‘白核’龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析 总被引：3，自引：1，他引：2
以‘白核’龙眼种子为试验材料, 比较两种蛋白质的提取方法, 确定了酚抽法提取龙眼种子蛋白。应用蛋白质组学研究技术, 分析了龙眼种子败育4个不同时期的蛋白质组变化, 共发现21个差异蛋白, 其中9个上调表达, 12个下调表达。通过MALD I/TOF /TOF2MS/MS质谱分析和蛋白质数据库检索, 共鉴定出12个差异蛋白, 分别为胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、RuBisCO大亚基结合蛋白α、β亚基、17 kD HSP、抗坏血酸过氧化物酶、胞质抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、Desication-related protein以及两个未知蛋白。这些鉴定出的差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关, 可能参与了龙眼种子败育过程。 相似文献