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1.
瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]是中国重要的蔬菜害虫,但其DNA甲基化研究尚未见报道。甲基化敏感扩增多态性是研究DNA甲基化的重要技术之一。通过对酶切反应、连接、PCR扩增和引物筛选等条件优化,建立瓜实蝇MSAP反应体系,即:120μL酶切体系中加入10 U的限制性内切酶与600 ng基因组DNA,于37℃酶切反应过夜;220μL连接体系中加入T4连接酶1 U,HpaⅡ-MspⅠ-adapter接头50 pmol,Eco R I-adapter接头5 pmol,并于16℃反应12 h;3连接产物稀释后进行PCR预扩增和选择性扩增,再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测结果。通过该体系筛选出适用于瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性研究的6对引物;瓜实蝇MSAP体系为瓜实蝇的表观遗传学研究提供了技术支持。 相似文献
2.
《吉林农业大学学报》2015,(4)
利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术进行鹿茸干细胞基因组DNA甲基化研究,建立并优化鹿茸干细胞MSAP技术分析的反应体系。对MSAP技术中的关键步骤DNA提取、酶切、预扩增反应中连接产物稀释倍数、选择性扩增反应中预扩增产物稀释倍数等条件进行了优化。同时,利用优化条件,应用ABI3730xl测序仪对64对引物进行筛选。结果表明:优化后的反应体系得到条带清晰、重复好和特异性强的选择扩增产物。建立的MSAP反应体系保证了MSAP图谱的稳定性和多态性,筛选出来的32对引物组合满足鹿茸干细胞以及后续鹿相关基因组DNA甲基化研究。 相似文献
3.
橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析 总被引：3，自引：0，他引：3
采用改良CTAB法提取橡胶树幼嫩叶片的基因组DNA,通过电泳检测酶切与连接、预扩增和选择性扩增等,建立橡胶树MSAP甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,并利用MSAP技术在基因组水平上对橡胶树幼态优势的形成机理进行研究。结果表明:利用该体系可获得扩增位点多、条带清晰、重复性好的图谱(共扩增出740个条带,404个甲基化位点,平均多态性比例为54.6%),并能有效区分基因组DNA甲基化的状态,为开展橡胶树同一品种不同类型种植材料的表观遗传变异研究奠定了基础。 相似文献
4.
为获得不同倍性泥鳅基因组DNA甲基化水平及模式,以泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,利用正交试验建立了甲基化敏感扩增多态性( MSAP)方法的反应体系,并利用该方法对二倍体泥鳅鳍基因组DNA进行了MSAP分析。结果表明：最佳双酶切反应体系为800 ng的泥鳅基因组DNA,用EcoR I、 Hpa II和Msp I各10 U,在37℃下反应8 h后即可酶切;最佳预扩增反应体系为模板4μL、预扩增引物0·8μL、0·2 mmol/L dNTPs、1·5 mmol/L Mg2+和 Taq 1 U;最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释20倍的模板2μL、引物1·5μL、0·375 mmol/L dNTPs、1·5 mmol/L Mg2+和 Taq 1 U;二倍体泥鳅全甲基化率分别为24·1%、20·8%、22·3%,半甲基化率分别41·4%、20·8%、33·3%,总甲基化率分别为65·5%、41·6%、55·6%。研究表明,该反应体系稳定、可靠、重复性好,为MSAP技术在多倍体泥鳅相关研究中的应用奠定了基础。 相似文献
5.
[目的]建立并优化黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术扩增反应体系,对中药材黄芪甲基化水平进行研究。[方法]磁珠法提取黄芪DNA后,采用Hpa II/Msp I 2种内切酶进行酶切,将酶切产物加上连接接头序列,经预扩增和选择性扩增反应,最终从黄芪MSAP的256对引物中筛选出最佳分辨引物4对。应用筛选到的4对引物,分析12种不同产地黄芪的甲基化模式,并对甲基化水平聚类分析。[结果]经MSAP检测12个黄芪样本半甲基化率在12.5%~26.7%,全甲基化率在25.6%~51.1%,总甲基化率在48.7%~73.5%,总体上黄芪样本的全甲基化率大于半甲基化率。采用NTSYSpc软件对黄芪样品Hpa II和Msp I多态性数据进行分析,获得UPGMA聚类图和主成分分析PCA图。[结论]MSAP技术能够很好地用于黄芪的甲基化分析,结合NTSYSpc软件能对不同产地黄芪之间甲基化水平进行聚类分析,且初步分析结果表明从UPGMA和PCA图上来看,地区相近的单株聚类分析表现出了一定的地域性。 相似文献
6.
以火龙果组培苗为材料,采用正交实验设计,优化了适用于火龙果的MSAP体系.结果表明,基因组DNA约300ng,采用EcoRI 10U和MspI/HpaII 2.5U两步酶切法,酶切较充分;使用20μL预扩增体系,含酶连产物1.0μL,Mix 10μL,上下游引物E+A/HM+T各2.0μL;选择性扩增反应体系20μL,含稀释50倍的预扩增产物3.0μL,Mix 5μL,上下游引物E+ANN/HM+TNN各2.0μL.选用17对引物检测发现,组培苗CCGG位点的甲基化程度约为24%,平均多态性比率为1.8%,表明火龙果组培苗在短期无性系繁殖中,存在一定程度的DNA甲基化差异. 相似文献
7.
《江苏农业科学》2016,(11)
为建立适合桃的甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,简称MSAP)反应体系,以桃PCM-1R、PCM-1G为材料,对MSAP技术中的关键因素进行优化。结果表明,500 ng基因组DNA用EcoRⅠ、HapⅡ或MspⅠ各10 U(0.5μL,2 000 U/m L),37℃保温12 h,即可酶切完全;25μL选择性扩增体系中,含有2μL10倍稀释的预扩增产物、各1μL上下游引物、2.5μL 10×Taq buffer、2.5μL d NTP mix(各0.2 mmol/L)、2.5μL25 mmol/L MgCl_2、0.25μL Taq DNA聚合酶。在该体系下选用256对引物对桃叶片进行甲基化模式分析,经筛选获得23对扩增条带清晰、重复性好的引物,PCM-1R、PCM-1G总甲基化率分别为28.0%、25.7%。 相似文献
8.
9.
《山东农业大学学报(自然科学版)》2014,(5)
甲基化敏感扩增多态性(MSAP)是DNA甲基化的主要研究技术,获得高质量的DNA是MSAP分析的基础。针对玉米Zea mays(L.)等干种子富含多糖、蛋白质且与核酸结合紧密等特点,采用改良的CTAB-SDS法对其基因组总DNA进行提取,对DNA进行质量检测,使用限制性内切酶Eo RI和Hpa II酶切,进行MSAP分析。结果表明,改良CTAB法可从玉米等干种子中获得纯度高、完整性好的总DNA,其OD260 nm/OD280 nm处于1.86,OD260nm/OD230大于2.00,产率达1.8μg/mg,多糖、蛋白质和RNA等杂质被去除干净,无降解现象,所提取的DNA可被等限制性内切酶完全双酶切,进行MSAP分析得到大量清晰稳定的多态性条带。结果表明改进的CTAB-SDS法更适合于干玉米种子高质量总DNA的提取。 相似文献
10.
黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究 总被引：2，自引：1，他引：1
［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。 相似文献
11.
以豫杂一号泡桐组培苗为材料,通过对影响MSAP反应体系各主要因素的优化,建立了适于泡桐MSAP分析的反应体系.结果表明,最佳酶切体系(25μL)包含300 ng模板DNA,16 U的EcoR I和10 U的HapⅡ(MspI),各双酶切8 h后,80℃失活20 min;最佳连接体系(25μL)是酶切产物20μL,0.16μmol.L-1EcoR I接头,1.6μmol.L-1HapⅡ(MspI)接头,2.5μL 10×T4Buffer,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;最佳预扩反应体系(20μL)是5μL稀释10倍的连接产物,100μmol.L-1dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)预扩引物各0.25μmol.L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.最佳选择性扩增反应体系(20μL)为5μL稀释30倍预扩增产物,100μmol.L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)选扩引物各0.3μmol.L-1,2.5μL 10×PCRBuffer.最后,利用优化的体系,筛选出了96对适宜于泡桐MSAP分析的引物. 相似文献
12.
应用MSAP技术对脐橙品种进行DNA甲基化分析 总被引：30，自引：1，他引：30
应用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对24个脐橙品种胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估。结果表明，脐橙基因组的CCGG序列中检测到4.7%～15.0%的DNA发生甲基化；18对扩增引物有10对显示有多态性，总共得到639条带，其中43条带为甲基化多态性带，平均甲基化多态性（P）比率达6.7%。结果显示DNA甲基化在脐橙中发生频繁，且品种之间的甲基化模式存在较大差异，脐橙CCGG序列中胞嘧啶甲基化外部（15.0%）多于内部（4.7%）。本文首次运用MSAP技术对脐橙品种进行胞嘧啶甲基化分析表明，使用MSAP检测脐橙品种多态性非常有效。 相似文献
13.
为研究莆田黑猪不同组织间基因组DNA甲基化水平差异及各组织甲基化水平在不同生长发育阶段之间的变化规律,采用甲基化敏感扩增片段多态性(MSAP)方法检测了1、25和210日龄莆田黑猪的心脏、肝脏、肌肉、脂肪、耳和尾6个组织基因组DNA的甲基化水平.结果表明:心脏和肝脏组织的甲基化水平随日龄增长呈下降趋势,且日龄间的甲基化水平差异显著(P0.05);25日龄肌肉组织的甲基化水平与1日龄的差异不显著(P0.05),但显著高于210日龄(P0.05);25日龄脂肪和耳组织的甲基化水平显著高于1和210日龄(P0.05);3个日龄间尾组织的甲基化水平差异不显著(P0.05);3个日龄的肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间的甲基化水平均存在显著差异(P0.05),表明DNA甲基化在肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间存在组织特异性. 相似文献
14.
运用MSAP研究镉胁迫对拟南芥幼苗基因甲基化的影响 总被引：4，自引：4，他引：0
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,并在环境胁迫响应中起重要作用。运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究0、0.5、1.5、5.0 mg·L-1Cd2+处理对拟南芥幼苗全基因组DNA甲基化水平的影响,结果表明:(1)不同浓度镉处理19 d后,叶片数、地上部鲜重无明显变化,但根长受到显著抑制;(2)选取10对引物扩增DNA酶切产物,所得三个镉处理造成的拟南芥基因组MSAP%均高于对照(35%);(3)随着镉处理的增大,拟南芥基因组甲基化(M)型条带依次减少,去甲基化(D)型条带逐渐增加,并且条带亮度也有所变化;(4)将特异性条带克隆测序后发现,mRNA、假设蛋白、表达蛋白、用于编码假定蛋白的mRNA序列V型质子ATP酶亚组、叶绿体中光合体系II CP47基因、叶绿体DNA、rRNA重复单元、核糖体蛋白等多种序列均存在甲基化修饰现象。这些特异序列可为我们寻找镉胁迫的生物标记物及胁迫响应的机理研究提供一定的依据。 相似文献
15.
毛白杨MSAP体系优化及DNA甲基化的初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
首次利用MSAP技术开展毛白杨DNA甲基化研究。在优化选择性扩增体系的基础上,对毛白杨亲子代的CCGG位点甲基化相对水平、CCGG位点胞嘧啶甲基化模式的遗传变异进行了初步分析。结果表明:①引物H/M+3、引物E+A+2、dNTP、Taq酶、预扩增产物稀释倍数分别为0.03 nmol、0.03 nmol、0.20 mmol/L、1 U(或1.5U)、40倍时组成的20μL反应体系经PCR扩增后电泳,可得到品质最佳的银染谱带。②毛白杨CCGG位点甲基化相对水平约为26.75%～29.39%,CNG甲基化相对水平低于CG甲基化相对水平,子代的甲基化相对水平低于亲本的甲基化相对水平。③子代中发生遗传变异的CCGG位点数之比为1∶1。遗传自亲本的CG甲基化位点数高于遗传自亲本的CNG甲基化位点数,遗传自父本的甲基化位点数高于遗传自母本的甲基化位点数;子代甲基化位点的变异以去甲基化为主,发生CG甲基化变异的位点数与发生CNG甲基化变异的位点数之比为1∶1。 相似文献