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《核农学报》2017,(11)
为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。 相似文献
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为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。 相似文献
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为进一步开发利用药用菊花种质资源,为药用菊花的遗传多样性及分子鉴定研究提供技术支持,建立并优化药用菊花的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系,在方差分析基础上,运用L25(56)正交设计在5个水平上对影响药用菊花SCoT-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物5个因素进行优化试验,并对PCR结果进行分析。建立了药用菊花SCoT-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 10 ng,引物0.8μmol·L-1,dNTPs 0.2 mmol·L-1,Mg2+2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,SCoT反应的影响因素依次为:Taq酶引物dNTPsMg2+模板DNA。优化的SCoT-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,结果表现出良好的稳定性、重复性和多态性丰富等特点,该体系的建立为药用菊花品种遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种研究奠定了基础。 相似文献
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本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明：CTAB法提取效果较佳。在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg^2＋．dNTP、引物、TaqDNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10μL体系中含有1μL 10×PCR bufier,Mg^2＋2．0mmol／L,dNTP100μmol／L,引物0-3μmol／L,彻DNA聚合酶0．5U和50ng模板DNA。利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物（落羽杉和墨杉）及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。 相似文献
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梨SRAP-PCR反应体系的建立与优化 总被引：11，自引：0，他引：11
SRAP标记是一种对ORFs进行扩增的新的分子标记技术，其具有方法简便、稳定，产率中等，不需预知物种的序列信息等特点，近年来在连锁标记的寻找与基因定位，种质鉴定，生物多样性研究，遗传图谱构建及比较基因组学等研究领域得到了应用。本研究开展了SRAP标记技术在梨树上应用的探讨，以3个不同梨品种为试验材料，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg２＋、dNTP、引物浓度、Taq酶等因子设置梯度实验，筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳反应条件。结果表明：在20μL反应体系中，模板DNA30ng，MgCl2 2.0mmol/L，dNTP 200μmol/L，正、反向引物各0.2μmol/L，DNA聚合酶1U。 相似文献
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为获得肉制品中牛、羊、猪、鸡、鸭等动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用5对牛、羊、猪、鸭和鸡等动物源性成分特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组),对多重PCR反应条件引物浓度和退火温度进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明,多重PCR方法最佳反应条件为鸭源特异性引物浓度0.12μmol·L~(-1),鸡源特异性引物浓度0.16μmol·L~(-1),猪源特异性引物浓度0.16μmol·L~(-1),羊源特异性引物浓度0.32μmol·L~(-1),牛源特异性引物浓度0.24μmol·L~(-1),退火温度58℃,d NTPs浓度0.20 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶添加量5 U,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪、鸡和鸭等5种动物源性成分多重PCR的g DNA检出限达到20 pg。应用优化后的多重PCR方法对21份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达42.86%。本试验结果为肉制品中该5种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。 相似文献
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药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。 相似文献
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目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCo T)是一种新型的遗传分子标记技术。本研究采用单因素水平设计方法,优化并建立梨的适宜SCo T分子标记体系,通过SCo T标记技术,分析了安徽省砀山县的43份梨(Pyrus spp.)的遗传多样性和亲缘关系。结果表明,优化后梨SCo T-PCR反应体系:10×Easy Taq Buffer(含2 mmol/L Mg2+)2.5μL,模板DNA终浓度30 mg/L,上下游引物终浓度1.0μmol/L,d NTPs终浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积为25μL。随机选取2个DNA模板进行引物筛选,最终从67条引物中筛选出16条扩增条带清晰且有差异性的引物,共扩增出145条带,其中多态性条带有126条,多态性比率为86.1%,每条引物平均扩增出9.1条带。SCo T标记的43个梨材料遗传相似性系数为0.517~0.931,平均值为0.685。聚类分析表明,在遗传相似系数为0.610的水平上,43份梨材料分为A和B两组;在遗传相似系数为0.746的水平上,A组又分为6个亚组(Ⅰ~Ⅵ)。所研究的43份梨材料具有丰富的遗传多样性,且能够被SCo T分子标记有效地检验,为进一步研究利用安徽省砀山县梨种质资源提供了依据。 相似文献
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采用CTAB法对硬叶兜兰叶片总DNA进行提取,通过正交实验设计,用SRAP正向引物me1（5＇-TGAGTCCAAACCGGATA-3＇）和反向引物em2（5＇-ACACACACACACACACT-3＇）对反应体系进行优化;并应用其进行种群遗传差异分析。结果表明：优化的20μL的PCR反应体系中DNA模板为90 ng,Taq DNA聚合酶1.6 U,dNTPs 0.30 mmol/L,MgCl22.0 mmol/L和引物各0.50μmol/L,经重复电泳验证适合进行硬叶兜兰的SRAP分析;利用该体系对7个不同种源的167份硬叶兜兰进行SRAP-PCR扩增,对筛选的10个引物扩增,共得到288条条带,其中多样性条带234条,多态位点百分率（PPB）为81.25%;种群的遗传距离值在0.065 9～0.191 6,UPGMA聚类结果显示供试种群在遗传相似度为0.863时,可以分为2支,即第一分支由马固、斗咀和杨柳井居群组成,第二支由古林箐、夹寒箐、小坝子和田坝居群组成。SRAP标记可较好地适用于硬叶兜兰种群遗传差异的鉴定。 相似文献
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本实验对影响SRAP-PCR体系中的Mg2＋、dNTPs和引物浓度等因子进行了体系优化,建立了一套适合白簕SRAP检测的25μL反应体系：1.5mmol/LMg2＋,1.5mmol/LdNTPs,1μmol/L引物,10ng模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶;进一步以白梗簕菜为模板,利用优化的体系进行多态性标记引物组合分析,共筛选出17对引物;利用这些引物对7个白簕品种进行SRAP遗传多样性分析,共扩增出461条谱带。其中多态性谱带155条,多态性谱带比率为33.6%,白簕品种间的相似系数为0.7077~0.9474。经UPGMA聚类分析结果显示,所检测的7个白簕品种分为两大类,其中亲缘关系较近的青梗簕菜和细叶密刺簕菜聚成了一组;而其余的4个种,包括白梗簕菜、细叶小刺簕菜、紫柄簕菜、大叶大刺簕菜和红梗簕菜,聚成另一组。 相似文献
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本试验利用L16（4^5）正交试验设计探寻葡萄SRAP—PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化。充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系。结果表明Mg^2＋浓度为影响葡萄SRAP—PCR反应的关键因素;优化的20μLSRAP—PCR反应体系中各组分的最适含量为：10×Buffer2．0μL,Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0.3mmol／L,引物0．4μmol／L,砌DNA聚合酶1．0U,模板DNA1．0ng／μL。利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对。本研究建立的适于葡萄SRAP—PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础。 相似文献
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本实验对白木香SRAP－PCR反应体系的影响因素（模板DNA,Taq酶,Mg^2＋d,NTP,引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP－PCR反应的最佳体系（20μL）：模板DNA50ng、引物0．30μmol／L、Mg^2＋ 1．5mmol／L、dNTP0．4mmol／L和购DNA聚合酶1．0U。适用于白木香的SRAP—PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序。 相似文献
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铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化 总被引：3，自引：0，他引：3
采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。 相似文献
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本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10（54）表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为：10×PCRBuffer（含Mg2＋）2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2＋、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。 相似文献
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本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。 相似文献