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1.
由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×106 CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×109 CFU·mL-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。 相似文献
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非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×107 CFU,次级文库总克隆数为1.6×107 CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×107 cells·mL-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本... 相似文献
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为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×107 CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。 相似文献
4.
为阐明海岛棉GbTCP10基因在棉纤维发育过程中的功能,以海岛棉品种新海21号为试验材料,克隆获得海岛棉GbTCP10基因,并利用酵母单杂交体系进行转录激活活性分析以及利用实时荧光定量PCR分析GbTCP10在棉花纤维不同时期的表达模式。结果表明,GbTCP10编码的蛋白与其他植物中的TCP蛋白具有较高的一致性;GbTCP10基因在开花后5 d纤维中表达量最高;GbTCP10不具有转录激活活性,推测GbTCP10可能参与棉花纤维的发育,是1个转录抑制子,本研究为了解棉花纤维发育机制提供了依据。 相似文献
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水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。前期研究发现Xoo PXO99A中一个编码Ⅲ型效应物的PXO_03420（hpaF）基因与病菌游动性、致病性和致敏性有关,为探讨hpaF基因编码产物在病菌与日本晴水稻中的互作关系,本研究采用Matchmaker酵母双杂交系统构建了日本晴水稻叶片高质量cDNA文库,文库重组率为87.6%,滴度为2.57×10^6pfu/mL。将文库与构建的Y187/pGBKT7_03420诱饵进行酵母双杂交,共得到26个阳性克隆。通过对阳性克隆测序所得结果进行结构域分析,初步鉴定HpaF与水稻叶片中具有WHY或PRK结构域的两个蛋白存在互作关系。本研究结果为进一步研究hpaF基因的功能奠定了基础。 相似文献
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FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花途径中的关键基因,前期研究中,在比较晚开花wym-97和早开花cx-49两个品种的BcFT启动子时,发现cx-49的BcFT启动子存在一个1 577 bp的插入片段。为探索该插入片段对不结球白菜开花的影响,本研究构建不结球白菜酵母杂交cDNA文库,继而利用酵母单杂交技术筛选与BcFT启动子互作的蛋白。结果显示,本研究所得cDNA文库的库容为1.8×106 CFU,重组率为100%,插入片段长度分布范围约400～2 000 bp,平均长度大于1 000 bp,表明不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建成功。自激活试验表明,800 ng·mL-1的金担子素(AbA)可以抑制诱饵载体的自激活。通过酵母单杂交试验筛选到结合BcFT启动子插入片段的上游蛋白BcSAP18和BcDEAR2。综上,本研究成功构建了不结球白菜酵母杂交cDNA文库并获得了BcFT启动子插入片段的互作蛋白,为进一步研究BcFT在不结球白菜开花中的调控机制奠定了基础。 相似文献
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目前,我们对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的外壳蛋白P10在该病毒侵染过程中的作用了解甚少。本研究利用酵母双杂交技术,以P10为诱饵钓取拟南芥cDNA文库,得到与P10互作的真核翻译起始因子eIF5A-2。通过分别构建猎物和诱饵载体共转化酵母,结果表明P10与AteIF5A-2在酵母中互作。利用农杆菌转染烟草表皮细胞瞬时表达体系发现,P10和AteIF5A-2形成融合荧光蛋白后,荧光主要形成囊泡状的结构。通过荧光共定位实验分析发现,P10与AteIF5A-2能够共定位。本研究结果进一步揭示了水稻黑条矮缩病毒的致病机制。 相似文献
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MYC2(myelocytomatosis protein2)是茉莉酸信号通路上的核心转录因子,参与植物防御反应、次生代谢调控及生长发育等多个方面。筛选丹参(Salvia miltiorrhiza)转录因子SmMYC2的互作蛋白,有助于深入研究丹参SmMYC2的生物学功能。克隆丹参中SmMYC2基因并构建到pGBKT7-GW(BD)上获得BD-SmMYC2诱饵表达载体,检测BD-SmMYC2对酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109细胞的毒性以及其自激活特性。结果表明,SmMYC2具有强烈的自激活活性。为进一步确定自激活区域,分别克隆SmMYC2的N端区域(含bHLH-MYC-N superfamily结构域)和C端区域(含HLH结构域),并将其构建到酵母表达载体BD上,检测SmMYC2-N-BD和SmMYC2-C-BD的转录激活特性,结果显示,含SmMYC2-NBD的酵母细胞在SD/-Trp/X-α-gal培养基上变蓝,并且在SD-Trp-His、SD-Trp-Ade培养基上均有不同程度的生长,而含SmMYC2-C-BD的酵母细胞在SD/-Trp/X-α-gal培养基上无变蓝现象,也不能在SD-Trp-His、SD-Trp-Ade培养基上生长,表明SmMYC2的N端有强烈的自激活活性,而C端没有。以SmMYC2-C-BD为诱饵筛选构建到AD载体的丹参cDNA文库,利用酵母双杂交技术,获得了与逆境胁迫相关的含WRKYGQK典型结构域的WRKY转录因子、过氧化物还原酶(peroxiredoxins, Prxs)家族蛋白以及琥珀酸半醛脱氢酶。本实验结果为进一步开展MYC2的互作蛋白研究提供了基础数据。 相似文献
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水稻抗稻瘟病防御系统中草酸氧化酶的鉴定 总被引：8，自引：0，他引：8
以水稻(Oryza sativa)OSK3蛋白激酶为诱饵，利用酵母双杂交系统中从水稻cDNA文库中筛选与其互作的蛋白，与植物抗病性相关的草酸氧化酶编码基因是所获得的阳性克隆之一，经检测报告基因lac Z的表达验证了互作的真实性。认为属于H2O2产生酶类的草酸氧化酶在水稻OSK3蛋白激酶介导的抗病途径中，可能是位于抗病信号传导链下游的蛋白。 相似文献
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为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。 相似文献
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番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。 相似文献
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为找到水稻中与南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)外壳蛋白P10(CP)相互作用的寄主蛋白,利用P10筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库,寻找水稻中与P10互作的蛋白并结合生物信息学技术进行分析,回转验证。结果表明,筛选到10个可能与P10互作的水稻寄主蛋白,如胚发育晚期丰富蛋白Lea14 - A、硫氧还原蛋白TRXh1、铁硫结合蛋白IscA以及真核生物起始翻译因子eIF-5A等。这些蛋白的发现说明水稻受到病毒侵染时,生长发育与营养物质的合成均受到影响。本研究结果为后续进一步研究P10蛋白的功能及其致病机制提供了理论依据。 相似文献
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为进一步探究杜氏盐藻促有丝分裂原活化蛋白激酶(DsMAPK)的功能,采用免疫共沉淀联合质谱技术筛选盐藻MAPK的互作蛋白。将pGS21a-MAPK质粒转入大肠杆菌BL21中表达MAPK蛋白并制备多克隆抗体;将培养至对数生长期的盐藻细胞进行盐胁迫处理,然后提取盐藻总蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;以内源性靶蛋白为诱饵,将细胞总蛋白与MAPK抗体进行共孵育,将经蛋白A/G琼脂糖珠纯化的免疫共沉淀复合物进行质谱检测。结果表明,制备的多克隆抗体特异性良好;筛选出165种特有的差异蛋白。通过GO和KEGG分析发现,这些差异蛋白主要参与了新陈代谢、遗传信息的传递以及信号转导等生物学调控过程。蛋白质互作网络分析发现,直接与MAPK相互作用的蛋白有4种。本研究结果为深入研究杜氏盐藻响应盐胁迫的分子机制提供了参考。 相似文献
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为探究高压脉冲电场(PEF)在酒精发酵工业上的实际应用,本研究以酿酒酵母为试验材料,在设定脉宽、频率、作用时间等参数不变的条件下,以电场强度为唯一变量,分别采用电场强度为1、6 kV·cm-1的PEF对酵母进行预处理。通过检测发酵底液中酵母生长量、葡萄糖消耗量和乙醇产出量的变化,探究PEF对酿酒酵母发酵能力的影响。结果表明,经12 h发酵后,在电场强度为1 kV·cm-1的PEF刺激作用下,酿酒酵母葡萄糖消耗量提高了10.18%,乙醇产出量提高了11.05%;当电场强度为6 kV·cm-1时,葡萄糖消耗量和乙醇产出量均降低。本研究结果为提高酿酒酵母的发酵能力提供了一种新方法。 相似文献
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通过基因合成构建了脱水反应元件(dehydration-responsive element,DRE)酵母表达载体,通过同源重组,利用SD-His-Ura平皿筛选获得了含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE双重报告子的酵母即得DRE报告子。建立小叶杨(Populus simonii)干旱模型,提取RNA,构建小叶杨cDNA AD融合表达文库,通过酵母单杂交的方法,用DRE报告子对小叶杨cDNAAD融合表达文库进行了筛选,得到了2个阳性克隆。结果表明,所构建的DER报告子被激活,可用于小叶杨DER转录因子的克隆。 相似文献
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为研制一种兼防大豆根腐病和根部虫害的高效、低毒种衣剂,本研究采用菌丝生长抑制法测定了96%烯效唑(uniconzole)原药、96%丙环唑(propiconazole)原药、97%阿维菌素(abamectin)原药对大豆根腐病致病菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxyporum)和禾谷镰孢菌(F. graminearum)的毒力,筛选最佳复配比,并利用湿研磨法制备种衣剂,进行室内盆栽苗的防效验证。结果表明,当烯效唑、丙环唑和阿维菌素的配比为5:1:2时,对2种镰孢菌抑制作用最佳。播种前,采用8%烯·丙·阿悬浮种衣剂0.2~0.5 g·kg-1处理大豆种子,能促进大豆出苗,且对大豆根腐病的相对防效达80.1%以上。本研究开发的8%烯·丙·阿悬浮种衣剂为进一步开展大豆根腐病和根部虫害田间防治奠定了基础。 相似文献