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1.
根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立 总被引：47，自引：0，他引：47
用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。 相似文献
2.
为建立高效的棕色棉茎尖遗传转化体系,以陆地棉棕彩选1号为材料,采用农杆菌介导茎尖的遗传转化方法,以培养7 d的棕彩选1号幼苗茎尖为受体,设计正交试验对共培养时间、共培养温度、菌液OD600、侵染时间等条件进行优化;此外,还研究了受体茎尖的大小及真空渗透等因素对转化效率的影响,初步建立了棕色棉茎尖农杆菌介导的遗传转化技术体系。结果表明,带有0.5 cm下胚轴的茎尖适合转化,适宜的农杆菌介导遗传转化条件为农杆菌菌液浓度OD600=1.0,侵染时间20 min,共培养时间3 d,共培养温度24℃。此外,真空渗透处理有助于抗性苗的发生。再生植株经在含100 mg·L~(-1)卡那霉素的培养基上筛选,获得102株抗性植株,再进行PCR鉴定和Southern杂交检测,共获得24株转基因植株,转化率为0.4%,且为单拷贝基因插入。本试验建立的优化条件为棕色棉的遗传转化奠定了理论基础。 相似文献
3.
为促进黄瓜功能基因组学研究,本研究开展了黄瓜T-DNA插入突变体快速构建与鉴定方法的研究。基于对黄瓜遗传转化体系农杆菌侵染活力和共培养条件的优化,本研究以绿色荧光蛋白GFP基因为插入片段,进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制,并利用荧光显微镜进行快速鉴定,最后采用TAIL-PCR技术对突变体进行分子鉴定,确定突变位点。结果表明,选取农杆菌侵染液在活化至12~18 h时具有最佳的活力和浓度,而最佳共培养温度为23℃。采用体式荧光显微镜快速鉴定,从2 978个转化外植体中鉴定得到3株表达GFP再生苗,转化率为1.00‰。TAIL-PCR成功鉴定了一个突变体,其插入位点位于CsaV3_1G032940基因的第10个外显子中,该基因在拟南芥中的同源基因为AT4G18950 (blue light-dependent H+-ATPase phosphorylation 1,BHP1),参与蓝光介导的气孔开放过程,但在正常栽培环境中该突变体的T0植株与野生型无差异。本研究结果对黄瓜功能基因组学研究具有重要意义。 相似文献
4.
为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。 相似文献
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在植物中通过农杆菌介导的基因瞬时表达和基于RNAi的基因沉默可便捷高效地研究基因功能。本研究采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)注射侵染法,利用GUS作为报告基因,探讨了月季(Rosa hybrida)品种、农杆菌菌株、开花级别、花瓣位置、农杆菌侵染浓度和侵染液成分等因素对月季花瓣中基因瞬时表达效果的影响。结果表明,月季品种蜜糖3级切花的中层花瓣中瞬时表达效果最佳;农杆菌菌株GV3101介导的瞬时表达效果最好,侵染浓度以OD600=0.9为宜,添加10 mmol/L MgCl2及10 mmol/L MES的侵染液效果优于重蒸水。同时,利用上述优化瞬时表达体系进行RNAi沉默,成功抑制了外源报告基因GUS和内源基因RhSAG的表达。相比对照,RhSAG沉默花瓣的萎蔫速度较慢,说明衰老进程得到延缓。该体系的优化为月季花瓣中基因功能的鉴定提供了有效工具。 相似文献
6.
农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究 总被引：3，自引：1，他引：2
采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。 相似文献
7.
本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(TtrpC)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROKⅡ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A. alternata转化效率的影响对体系进行优化。结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200mL(OD600=0.15),A. alternata分生孢子浓度为106个/mL,在A. tumefaciens的预培养时期以及与A. alternata共培养时期分别加入200μmo1/LAS,共培养时间48h,转化率达120～200个/105分生孢子。在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达。该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础。 相似文献
8.
本研究以优良玉米自交系交51为材料,通过农杆菌介导的茎尖转化将海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1和葡萄花青素调控基因VlmybA2转入玉米中。确立了最佳的除草剂Basta筛选浓度,研究了不同真空渗透压、农杆菌液浓度、侵染时间等因素在转化过程中对玉米植株存活率的影响。结果表明80 mg/L除草剂Basta为最佳筛选浓度,真空渗透压为60 kPa、农杆菌液浓度OD600为0.8、侵染时间为8 min时是最佳转化条件,经过GUS组织化学染色和PCR检测,证明TPS1基因和VlmybA2基因已经整合到玉米基因组中。 相似文献
9.
香蕉枯萎病是世界范围内香蕉种植区最为严重的病害之一,严重威胁和影响着香蕉产业的发展。本文针对香蕉枯萎病病原菌的4号生理小种,建立了农杆菌介导的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的优化体系是:农杆菌在IM培养基诱导前农杆菌OD600为0.15、农杆菌经IM液体培养基诱导的时间为7h、乙酰丁香酮(AS)浓度为150μmol/L、Focr4孢子浓度为1×106个/mL、共培养时间为48h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。在此条件下,转化效率能达到700～800个转化子/106个香蕉枯萎病菌孢子。PCR验证表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中。目前,应用该转化体系已获得2300多个转化子,为后续克隆相关致病基因打下了良好基础。 相似文献
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棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得 总被引：1，自引：0，他引：1
为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP. 相似文献
11.
为建立葡萄叶片TRV-VIGS系统,分析验证VvANR基因功能,本研究以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导基因沉默表达载体pTRV2-ANR,采用真空侵染和主叶脉针孔注射法分别侵染葡萄幼嫩、成熟叶片,观察表型并测定原花青素含量,实时荧光定量PCR测定被侵染叶片中VvANR及其相关基因表达。结果表明,真空侵染的幼嫩、成熟叶片分别于第6、第7天出现漂白,侵染15 d后,幼嫩叶片几乎全部漂白,成熟叶片大面积漂白。主叶脉针孔注射侵染的幼嫩、成熟叶片分别于第17、第19天出现漂白;侵染25 d后,幼嫩和成熟叶片发生全叶漂白,且漂白均沿主叶脉逐渐扩展至整个叶面;对照均未发生漂白现象。pTRV2-ANR侵染后叶片中原花青素含量极显著降低,VvANR基因表达量极显著降低,且原花青素生物合成相关基因VvLAR1、VvLAR2、VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvUFGT表达量显著降低,除VvUFGT表达量呈显著差异外,其余均呈极显著差异;而VvANS、VvDFR表达量轻微上调,且与对照差异不显著。本研究建立了葡萄叶片VIGS体系,为基因功能快速验证提供了新方法;同时,揭示了葡萄叶片中原花青素含量、VvANR表达及与相关基因的关系,本研究为完善葡萄原花青素积累机制奠定了一定的理论基础。 相似文献
12.
BBX是调控植物非生物胁迫相关基因表达,响应植物逆境胁迫的重要锌指蛋白类转录因子。为探究BBX在独行菜(Lepidium apetalum)幼苗耐受低温生长中的表达响应及其密码子偏好性,本研究基于独行菜转录组数据,筛选独行菜BBX编码基因的cDNA序列,并从独行菜幼苗中克隆获得全长733 bp的基因编码区序列,命名为LaBBX。序列分析表明,LaBBX由242个氨基酸组成,包含2个B-box锌指蛋白结构域,蛋白分子量为61.66 kDa,等电点为5.09,无信号肽和跨膜区。独行菜幼苗受低温胁迫时,LaBBX基因显著上调表达,6 h上调表达至21倍,且24 h内均呈现高水平表达,说明该转录因子可能在独行菜幼苗受低温胁迫时起重要作用。偏好性分析结果显示,独行菜LaBBX基因的ENc、CAI值和GC含量分别为55.453、0.244和46.78%,其密码子使用偏性较弱,相对偏好使用AT,高频密码子有8个,CDS序列及RSCU聚类分析中与十字花科植物最相近;其偏好性的形成与突变和自然选择等诸多因素相关,酵母菌表达系统更适合作为LaBBX基因的异源表达受体,拟南芥是适宜LaBBX基因的遗传转化受体。本研究为了解独行菜LaBBX基因的异源表达及基因功能提供了重要参考。 相似文献
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为研制一种兼防大豆根腐病和根部虫害的高效、低毒种衣剂,本研究采用菌丝生长抑制法测定了96%烯效唑(uniconzole)原药、96%丙环唑(propiconazole)原药、97%阿维菌素(abamectin)原药对大豆根腐病致病菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxyporum)和禾谷镰孢菌(F. graminearum)的毒力,筛选最佳复配比,并利用湿研磨法制备种衣剂,进行室内盆栽苗的防效验证。结果表明,当烯效唑、丙环唑和阿维菌素的配比为5:1:2时,对2种镰孢菌抑制作用最佳。播种前,采用8%烯·丙·阿悬浮种衣剂0.2~0.5 g·kg-1处理大豆种子,能促进大豆出苗,且对大豆根腐病的相对防效达80.1%以上。本研究开发的8%烯·丙·阿悬浮种衣剂为进一步开展大豆根腐病和根部虫害田间防治奠定了基础。 相似文献
14.
为挖掘和利用福建漳浦普通野生稻稻瘟病抗性资源,采用自然诱发对福建漳浦普通野生稻2个居群(石湖潭和古糖)67份材料的苗瘟、叶瘟和穗瘟进行抗性鉴定评价,并用Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm共6个抗性基因的功能标记分析基因型。结果表明,不同时期病级差异明显,变异系数在31.65%~43.46%之间,苗期平均病级为7.51,分糵期和成熟期平均病级分别为5.15和5.84,2个自然居群3个时期的稻瘟病抗性差异不显著,筛选出M1044、M2010和M2016共3份表现中抗(3级)的材料。漳浦野生稻稻瘟病总体抗性差,易感稻瘟病。苗瘟与叶瘟呈极显著正相关,相关系数为0.82;穗颈瘟与苗瘟和叶瘟呈极显著正相关,相关系数分别为0.33和0.41。67份材料中,4份含有稻瘟病Pi9抗性基因、17份含有Pi5抗性基因、23份含有Pi54抗性基因、2份含有Pikm抗性基因,均不含Pi2、Pid2这2个抗性基因;材料含有的抗性基因数量在0~3个之间,其中有30份材料不含所检测的抗性基因,29份材料含1个抗性基因,7份材料含2个抗性基因,1份材料含3个抗性基因。本研究结果为漳浦野生稻资源的深入挖掘和利用提供了一定的理论参考。 相似文献
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采用水培试验,研究了0.20mmol·L-1Cd2＋浓度下,0.10mmol·L-1亚精胺（Spd）浸种处理对油菜幼苗叶片抗氧化系统的影响。结果表明,Cd胁迫使油菜幼苗叶片褪绿,叶绿素总量及叶绿素a/b含量与对照相比极显著降低,Spd浸种处理可显著逆转这一变化,缓解叶片的褪绿现象。与Cd处理相比,Spd浸种显著或极显著提高了油菜幼苗中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和可溶性蛋白、谷胱甘肽（GSH）含量,从而降低了丙二醛（MDA）含量,极显著降低了超氧阴离子（O-2·）含量,缓解了Cd的氧化胁迫作用。总之,Spd浸种处理通过提高Cd胁迫下植株体内抗氧化酶及抗氧化剂活性,降低活性氧（ROS）水平来缓解重金属胁迫对油菜幼苗的伤害,提高幼苗的耐重金属能力。 相似文献
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为探究蔗糖浸种缓解玉米幼苗铜胁迫的能力,采用浸种法研究了342.3 mg·L-1蔗糖浸种处理对0、100、200、400 mg·L-1硫酸铜处理玉米幼苗生理生化指标的影响,并进行生理生化指标与玉米铜胁迫恢复指数的灰色关联分析。结果表明,蔗糖浸种可显著提高一定程度铜胁迫下玉米幼苗的株高、根长、相对根长、相对株高、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性。生理生化指标与蔗糖处理对铜胁迫恢复指数的灰色关联度排序为:相对根长(0.799)>相对株高(0.775)>根长(0.767)>脯氨酸含量(0.749)>POD活性(0.740)>可溶性蛋白含量(0.699)>可溶性糖含量(0.673)>CAT活性(0.664)>叶绿素含量(0.647)>SOD活性(0.601)>株高(0.579)。综上可知,蔗糖浸种在一定程度上能有效缓解玉米幼苗的铜胁迫,抗性鉴定时选择相对根长、相对株高、根长、脯氨酸含量、POD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT活性等强关联指标可以提高选择效率,这为玉米抗性育种提供了参考。 相似文献
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由籼稻品系杂交后代中发现1个黄绿叶突变体,命名为ygl15。为揭示突变体ygl15叶色变异机制,对其进行了表型鉴定和基因定位分析。结果表明,突变体ygl15从苗期开始表现为黄绿叶,叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著下降,并最终导致其农艺性状受到影响,表现为株高、有效穗数、单株总粒数和单株实粒数显著下降,穗长、每穗粒数和结实率的变化不显著,千粒重略有提高;基因表达分析表明,突变体ygl15叶片中,叶绿素合成和光合系统相关的基因表达上调,但血红素合成相关的基因表达下调或不变。遗传分析表明,ygl15的突变表型受1对细胞核隐性基因控制。以突变体ygl15和中花11杂交的F_2群体为定位群体,经过初步定位和精细定位,将ygl15基因定位在水稻第3号染色体上的分子标记M08124～M08175之间,物理距离约79 kb。本研究结果为进一步克隆ygl15突变基因和研究基因功能奠定了一定的理论基础。 相似文献
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为揭示谷子MDH基因对逆境胁迫的响应,本研究通过序列比对得到2个谷子苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)基因SiMDH1、SiMDH2,并对SiMDH1和SiMDH2的编码蛋白特征、基因结构、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,用荧光实时定量PCR(qPCR)检测了SiMDH1和SiMDH2在苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫和不同光照强度下的表达。蛋白特征参数和序列分析表明,SiMDH1和SiMDH2蛋白特征参数相似度很高,序列非常保守,都含有MDH基因的特征功能域苹果酸酶NAD结合域和苹果酸酶C端功能域。亚细胞定位预测显示,SiMDH1和SiMDH2主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体。启动子区域顺式元件分析发现,在SiMDH1和SiMDH2启动子区域含有大量光应答、激素类和其他类应答元件。苗期逆境qPCR表达谱分析发现,SiMDH1和SiMDH2受脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、高盐和低温不同程度诱导,揭示SiMDH1和SiMDH2参与了谷子苗期非生物逆境胁迫应答。进一步分析发现,SiMDH1和SiMDH2参与了谷子在拔节、抽穗、灌浆期的干旱应答,而光照强度会显著影响SiMDH1和SiMDH2基因在不同生育期的表达。本研究为进一步分析MDH逆境应答机制以及利用基因工程方法改善作物抗逆性提供了试验和理论支持。 相似文献
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为探究毛红椿凋落叶水浸液的自毒作用,采用生物测试法研究毛红椿凋落叶水浸液对自身种子发芽和幼苗生长的影响,并结合气相色谱质谱联用(GC-MS)技术分析凋落叶水浸液石油醚、乙醚、氯仿、甲醇4种不同极性萃取组分中存在的自毒物质。结果表明,凋落叶水浸液对毛红椿种子发芽及幼苗生长、存活率等均有抑制作用,浓度越高抑制作用越强,中浓度溶液(100 g·L-1)对种子发芽和茎长达到显著抑制水平,对种子发芽率、发芽势、发芽指数、茎长的抑制率分别为18%、31%、31%和17%;低浓度溶液(10 g·L-1)对根长的抑制达到显著水平,抑制率为25%。毛红椿凋落叶水浸液4种不同极性萃取组分中共鉴定到22种化合物,总体含酰胺类、长链脂肪酸、酚类、苯甲酸衍生物、烷烃类、腈类、二甲苯、松油烯及谷甾醇等物质,其中酰胺类、长链脂肪酸、酚类、苯甲酸衍生物成分可能为毛红椿自毒物质。本研究结果为探索毛红椿的濒危机制,促进毛红椿的实生更新提供了理论依据。 相似文献
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为培育威灵仙(Clematis chinensis)品种,以威灵仙种子为试验材料,用不同剂量(0、50、100、150、200 Gy)的137Cs-γ射线进行辐射处理,研究辐射对威灵仙种子发芽及幼苗生长的影响。结果表明,50 Gy辐射剂量可促进种子发芽和成苗;威灵仙种子辐射半致死剂量(LD50)为109.5 Gy。辐射处理后植株的叶形呈现心形等7种变异,其中50和100 Gy辐射剂量的变异叶形种类较多,分别出现了5种和4种变异。植株苗高、分蘖数、地径和节间长度随着辐射剂量的增加而降低。此外,随着辐射剂量的增加,相对叶绿素含量降低; Fv/Fm、Fv/Fo和ETR总体呈先升后降的趋势,均在50 Gy剂量下达到最大值;qP呈增加趋势;NPQ均呈下降趋势,100 Gy剂量时,两者降低最显著。试验表明辐射剂量为50~100 Gy时,威灵仙幼苗茎、叶变异比例较高,植株生长和光合系统运转状况良好。结合威灵仙种子半致死剂量认为,137Cs-γ辐射威灵仙育种的适宜剂量范围是50~109.5 Gy。本文研究结果为铁线莲辐射育种提供了科学依据。 相似文献