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1.
参照GenBank中安哥斯牛杀菌/通透性增加蛋白(BPI)序列,设计合成1对引物.应用RT-PCR技术,从荷斯坦奶牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白N端,将该序列与原核表达载体pGEx-4T-1连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BPI.重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果表明,获得了BPIN端长度为714bp的cDNA序列,序列分析证实在第503位出现了点突变.重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测重组蛋白约在52 kD处出现特异性蛋白条带. 相似文献
2.
本文提出的方法是首先利用已知基因序列设计三个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3’端为常见酶切位点、5’端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物,用p14外引物与9个酶切位点引物进行第一轮PCR扩增,其中前5个反应的退火温度较低可以将酶切位点引物的5’端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,退火温度较高是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上。为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第二轮和第三轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序。为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x与p14(或p15)配对,直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序。利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5’UTR序列142bp,并已在GenBank注册（登录号FJ263960）。利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果FPPS基因启动子序列。这说明用该方法获取基因邻近的未知序列是可行的。 相似文献
3.
利用已知基因序列设计3个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3'端为常见酶切位点、5'端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物.用p14外引物与9个酶切位点引物进行第1轮PCR扩增,其中前5个反应采用较低的退火温度,目的是将酶切位点引物的5'端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,目的是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上.为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第2轮和第3轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序.为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x,将f3x与p14(或p15)配对、直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序.利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5'UTR序列142bp,并已在GenBank注册(登录号FJ263960),利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果(Malus domestica Borkh.)法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)启动子序列. 相似文献
4.
设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。 相似文献
5.
通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3．3kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99％。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS—PAGE分析表明有88kD和34kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。 相似文献
6.
用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因 总被引：5，自引：0，他引：5
以λgtll为载体,构建家兔睾丸文库.平板扩增6×105pfus,提取λDNA作为PCR模板.根据GenBank已发表spl0cDNA的同源序列,选择高度保守区域设计5'端引物(SP5'),另加与构建文库载体λgtll序列互补的正向(FP)或反向引物(RP)共同配对组成PCR循环引物.利用SP5'+Rp或SP5'+FP引物对扩增出sp10cDNA的3'端.根据3'端的测序结果,设计sp10的3'端引物(SP3'),利用SP3'+RP或SP3'+FP引物对扩增出sp10cDNA的5'端.应用该方法成功地克隆了家兔精子膜蛋白sp10cDNA(rsp10),说明该方法是一种快捷可行的cDNA克隆方法. 相似文献
7.
两轮多重反转录巢式PCR方法扩增全长GalUR基因 总被引：2，自引：0，他引：2
研究了两轮多重反转录巢式PCR扩增全长基因的方法.先用多重巢式引物和cDNA进行第1轮PCR扩增;再用纯化的第1轮PCR产物和相同的引物进行第2轮扩增;最后通过改变Mg^2＋浓度、退火时间和退火温度进行PCR条件的优化,以增加PCR扩增的产量,用于克隆.结果显示该方法方便和快速地扩增出了草莓（Fragaria ananassa cv.SweatCharlie）高产量和高质量的全长GalUR基因,也非常快速地扩增出了用于基因构建的带有酶切位点的全长GalUR基因.该方法也可以用于其它全长基因的克隆. 相似文献
8.
本研究介绍一种分子克隆的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,目的片段上游引物的5＇端和下游引物的5＇端各设计约25 bp与目标载体末端同源的序列,或目的载体反向游引物的5＇端和正向引物的5＇端各设计约25 bp与目标片段同源的序列,以便进行融合PCR,PCR反应扩增目的片段后,与载体进行融合PCR。用DpnⅠ消化原始甲基化模板,然后进行转化和重组子鉴定。结果表明利用该方法成功将目的片段插入载体。证明这是一种简便、通用、高效并值得推广的分子克隆的新方法。该方法不需要骨架载体上的特异性酶切位点,特别适用于插入片段中无限制性酶切位点的载体改造;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该分子克隆方法还可以实现基因的无缝克隆。 相似文献
9.
高恒 《农业生物技术学报》2009,17(4)
目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。 相似文献
10.
高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。 相似文献
11.
为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。 相似文献
12.
热不对称性PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL—PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应，选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增。TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分子生物学研究领域广泛应用。本文从TAIL-PCR技术原理出发，对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述，并介绍TAIL—PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景。 相似文献
13.
摘要：传统的纯化外源基因的方法主要是通过多代自交,该方法耗时长,效率低。通过对转基因材料中外源基因T-DNA区域插入位点侧翼序列的分析,本文开发了筛选纯合转基因植株的新方法。首先,利用酶切连接接头的PCR方法,我们在番茄转基因植株中扩增外源基因Avr3a的两翼序列并测序;然后通过该序列设计的引物在转基因植株中验证,得到的两翼序列通过与SGN数据库比对分析,发现外源基因的插入位点有40bp的碱基缺失;最后利用侧翼序列和边界序列设计的引物,成功在转基因T1代植株中筛选出纯合单株,并在T2代进行了验证。 相似文献
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采用L16（45）正交设计试验对东兴金花茶SSR-PCR反应的五因素（Mg^2＋,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA浓度）四水平进行了优化试验,然后利用优化后的反应体系,将31对同属植物SSR引物（4对茶树,7对山茶和20对金花茶引物）运用于东兴金花茶材料上,筛选适宜东兴金花茶遗传分析的SSR引物。结果表明,东兴金花茶最佳反应体系（15μL）及扩增条件为：Mg^2＋1.50 mmol/L、dNTP 0.30 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 40.00 ng;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s（因引物而异,该温度为引物CN10的退火温度）,72℃延伸40 s,共36个循环;72℃最后延伸10 min。山茶属的不同植物之间可以共享部分SSR引物信息,东兴金花茶获得了9对能扩增出条带清晰且具有多态性的引物,引物最适退货温度为54-60℃,观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.433-1.000和0.391-0.932。本试验为下一步进行的东兴金花茶遗传多样性分析、遗传图谱的构建等研究奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌特异性的气溶素基因序列,设计1对引物,利用普通PCR技术扩增获得hlyA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了快速检测致病性嗜水气单胞菌的SYBR GreenⅠ荧光定量诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对非致病性嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、柱状黄杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达1.0x101拷贝/uL。结果表明研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特点,适合于大鲵临床样品的检测。 相似文献
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真核生物延伸因子(EF1a)是一种重要的内参基因,广泛应用于RT-qPCR中。为获得印度南瓜EF1a基因,开发合适的荧光定量PCR引物,本研究通过转录组测序和RT-PCR方法获得了1条长度为1 701 bp的cDNA,命名为CmEF1a,GeneBank登录号:MH310443。结果表明,CmEF1a包含1个ORF,大小为1 344 bp,编码447个氨基酸,理论分子大小约为49.30 kD, 蛋白质等电点为9.14。Wolf Psort分析发现, CmEF1a蛋白亚细胞定位于细胞质基质中;Motif Scan分析显示, CmEF1a蛋白质的氨基酸序列2~432位和322~430位分别为EF1结构域和EF1的C端保守结构域。同源性分析表明, CmEF1a基因编码的蛋白质与同为葫芦科的中国南瓜、甜瓜和黄瓜同源蛋白的相似性达到99%,具有高度的保守性。在此基础上设计了1对RT-qPCR引物, 该引物具有较高的特异性和扩增效率, 在印度南瓜不同组织和不同胁迫处理下均能稳定表达, 适合作为内参基因应用于印度南瓜基因表达研究。本研究结果为印度南瓜重要功能基因的表达分析及相关分子调控机制的研究奠定了一定的理论基础。 相似文献
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本实验通过U255（5^4）均匀设计实验研究,对枇杷ISSR—PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg^2＋、引物5个组分的浓度进行优化。获得25μL反应体系中各成分的适宜浓度或用量分别是：模板DNA为10ng、dNTPs为0．5mmol／L、TaqDNA聚合酶为1U、Mg^2＋为2．5mmol／L,引物为0．4μmol／L。与单因素梯度优化体系相比,操作简便,简化了实验步骤,获得的实验结果可靠,从100条ISSR引物中筛选出27条扩增良好的引物,并获得了这些引物的最佳退火温度,经琼脂糖凝胶电泳获得了清晰的图谱。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行枇杷种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个标准化程序。 相似文献