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青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功. 相似文献
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以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择. 相似文献
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[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9（KIF Ⅱ-9）cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFII-9）cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。 相似文献
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《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2015,(3)
根据小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)mRNA序列设计4对shRNA序列,通过退火连接到shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo,构建相应的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA。转染C2C12细胞后,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot试验对shRNA基因沉默后MSTN mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果表明:设计并构建的4个MSTN shRNA过表达载体,在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平,其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高,MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72%、74%,差异极显著(P0.01)。该研究成功设计了4个MSTN shRNA序列并构建了相应的高效表达载体,为后续通过调控MSTN表达研究其在肌肉发育中功能奠定基础。 相似文献
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为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。 相似文献
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利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。 相似文献
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指天蕉β-1，3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1, 3-葡聚糖酶基因,为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因,据其保守区域设计一对简并引物,通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp,其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中,与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高（71%）。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物转基因抗病育种研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。 相似文献
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参照拟南芥WRKY33转录因子基因序列设计引物,利用RT—PCR技术从大白菜中克隆了WRKY33基因编码区460bp的序列,利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建WRKY33基因沉默植物表达载体,为进一步研究该基因在植物与软腐病菌互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将WRKY基因片段连接至pUCm—T载体上,用PstI／BamHI和风fI／Xho1分别对pUCm—WRAT载体进行酶切,得到2个WRKY基因片段;先后将其连接到pBSSK—in载体上,构建成pBSSK．WRKY-in—WRKY载体,该载体中的2个WRKY片段大小一致,反向重复;并用SacⅠ／KpnⅠ酶切pBSSK—WRKY-in—WRKY载体得到WRKY-intron—WRKY片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默植物表达载体。 相似文献
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采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α-干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α-干扰素基因亚克隆到表达载体pET-28α( )中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定.测序结果表明,该基因(sxDuIFN-α)由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸.该基因与GenBank公布的鸭α-干扰素基因(X84764,AB128861)的核苷酸序列同源性分别为99.3%和99.1%,氨基酸序列同源性均为97.9%.表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量为20.7 kD的DuIFN-α.该产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性. 相似文献
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茶树β-1,3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的优化表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从茶树中获得β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase , β-1,3-glu )基因cDNA,发现其中存在着一些序列,它们与核糖体竞争性地结合pET32a载体上的RBS位点, 造成该基因cDNA在原核生物中很难表达.作者对其中的两处基因序列进行了突变,通过设计PCR引物,利用密码子的简并性,保证了突变后蛋白质的一级结构不变.使葡聚糖酶基因在大肠杆菌中明显表达.通过SDS-PAGE分析,证明表达产物分子量约75.8 kD,与预计大小一致,并通过水杨酸法对其进行酶活测定,证明其有活性. 相似文献
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华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。 相似文献
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根据已知的番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)CCD7和CCD8基因的序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段,通过特定酶切将2个基因进行拼接,再将串联基因以反向重复的方式连入p UCCRNAi载体,并定向插入到p35植物表达载体上。结果表明,克隆获得了大小约为400 bp的CCD7和CCD8基因片段,基因片段拼接后获得800 bp左右的串联片段CCD7-8;将该基因片段插入p UCCRNAi载体后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重复序列In-7-8,并成功插入到植物表达载体p35中,通过酶切分析,RNAi载体构建正确。最终成功构建了番茄CCD7和CCD8 2个串联基因的RNA沉默表达载体p35-In-7-8。 相似文献
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为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。 相似文献
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几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究 总被引：4，自引：0，他引：4
采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。 相似文献
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通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达. 相似文献
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水牛α-乳清蛋白基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据报道的奶牛α-乳清蛋白基因核苷酸序列设计和合成4对引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了水牛α-乳清蛋白全基因的核苷酸序列.结果表明,克隆的水牛α-乳清蛋白基因全长3 038 bp,包括5′侧翼区,3′侧翼区,3个内含子和4个外显子(该序列已被成功提交到GenBank,序列接收号为EU422984).核苷酸序列比对结果表明,水牛α-乳清蛋白基因与报道的奶牛该基因的核苷酸序列同源性为97.53 %.水牛α-乳清蛋白成熟肽的氨基酸序列与奶牛相比有两个氨基酸的差异.与奶牛相比,水牛α-乳清蛋白基因5′调控区发生了多处插入突变和碱基替换突变,这些插入和替换突变可能与水牛乳汁中α-乳清蛋白的高水平表达有关. 相似文献