猪Resistin基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达     

王群 《农业生物技术学报》2007,15(5)

应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中，经酶切及测序鉴定后，采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞，用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1－RSTN，经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1－RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。  相似文献   

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

曹三杰  邓飞  杨恒  黄小波  文心田 《农业生物技术学报》2008,16(6)

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果   总被引：2，自引：2，他引：0  

贾松涛  闫若潜  崔保安  吴志明  张志凌  张健  赵雪丽 《农业生物技术学报》2008,16(5)

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2.  相似文献   

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果研究     

闫若潜贾松涛  崔保安吴志明  张志凌张 健 《农业生物技术学报》2008,16(5)

摘要：为了研究猪圆环病毒2型（PCV2）核酸疫苗,本研究采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension-PCR , SOE-PCR）方法通过一基因柔性接头（linker）(G4S)3将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2的成熟肽基因（PoIL-2）构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,对阳性重组质粒进行双酶切后回收嵌合基因亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒（rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2）瞬时转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光试验和PoIL-2蛋白ELISA试验方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋白(rCap-linker-PoIL-2 )生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2免疫Balb/c小鼠,采用PCV2抗体ELISA检测试剂盒检测rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在小鼠体内的免疫效果,并与只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒pcDNA3.1/OFR2 (rpcDNA3.1/OFR2)进行免疫效果比较。结果表明：成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1(+)重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞内进行了成功表达,表达的rCap-linker-PoIL-2蛋白存在于COS-7细胞的细胞浆内,可与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap蛋白和PoIL-2蛋白的双重生物学活性; rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导小鼠产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2。本研究为PCV2的核酸疫苗研制奠定了基础。  相似文献   

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达     

单艳菊  胡艳  朱春红  束婧婷  丁晶  李慧芳  陈宽维 《广西农业生物科学》2011,30(5):539-543

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。  相似文献   

绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在 HEK 293T细胞中的表达     

吴凌娟  仲飞  解民  靳慧君  王微  韩冬梅 《农业生物技术学报》2008,16(6)

采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。  相似文献   

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析     

刘学  李洪辉  王中华  林雪彦  闫振贵  侯秋玲  王云  胡志勇  师科荣 《农业生物技术学报》2016,(3):366-372

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.  相似文献   

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达     

李运娜  黄金贵  李建华  宫鹏涛  杨举  李赫  李淑红  张西臣 《广西农业生物科学》2011,30(4):311-315

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI,构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞,利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。  相似文献   

黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达   总被引：2，自引：0，他引：2  

张茂  周庆丰  杜云平  刘德武  孟繁明  周美华  吴珍芳 《农业生物技术学报》2010,18(2):368-373

通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL.  相似文献   

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性     

亓丽红  朱剑英  艾武  黄兵  于可响  刘涛  秦卓明  宋敏训 《农业生物技术学报》2012,20(11)

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.  相似文献   

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建     

曹学亮  焦硕  苏从成 《农业生物技术学报》2007,15(6):1066-1067

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。  相似文献   

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达     

李艳玲  王颖  党文庆  郝柱  徐宁迎  张金枝 《农业生物技术学报》2012,20(8):948-954

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。  相似文献   

H5N1亚型禽流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中表达与活性鉴定     

顿继凤  周迎春  蒲娟  刘金华 《农业生物技术学报》2007,15(4):547-551

摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。  相似文献   

肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建和表达     

张路培  杨润军  甘乾福  许尚忠  李俊雅  高雪  任红艳  陈金宝 《农业生物技术学报》2009,17(3):409-412

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明,融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达,并具有免疫原性。  相似文献