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松材线虫Hsp70基因的克隆与原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
热激蛋白70(Hsp70)是已知热休克蛋白家族中最重要的-种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术, 从松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列(共2 061 bp)(GenBank登录号为:DQ785812)。其编码-个分子量为70 kD的642个氨基酸的蛋白序列, 含有3段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明, 氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性, 并与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此, 将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了-个原核表达载体Bx70pEASY-E1, 当IPTG终浓度为0.4~0.8 mmol/L时, 能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1基因的克隆和表达, 将为松材线虫的生态适应性机理研究奠定基础。 相似文献
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松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种对我国林业危害极大的外来入侵种,具有繁殖力强,扩散范围广的特点。为探究松材线虫的发育调控机制,本研究通过转录组分析和实时荧光定量PCR技术,比较了不同虫态松材线虫发育差异表达基因及功能富集分析。利用LC/MS技术检测了松材线虫代谢物中的蛔甙成分及含量。结果显示:繁殖型和扩散型虫态的差异表达基因主要与滞育和发育调控相关。繁殖型虫态的daf-9基因表达水平显著高于扩散型松材线虫,扩散型LIV期线虫的daf-12、daf-2及daf-16基因表达量显著高于繁殖型松材线虫。Ln和LIII的蛔甙成分比较分析结果显示:繁殖型松材线虫短链蛔甙asc-C3、asc-ΔC7含量显著高于扩散型松材线虫,长链蛔甙asc-C9含量低于扩散型松材线虫。推测松材线虫DAFs基因与蛔甙可能参与松材线虫扩散型虫态的形成。 相似文献
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利用RACE技术克隆中华卵索线虫Ovomermis sinensisβ-actin基因,RT-PCR方法检测该基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达情况。结果首次获得了中华卵索线虫β-actin基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1636bp,其中ORF长1131bp,编码376个氨基酸;5′UTR长137bp;3′UTR长367bp。由该cDNA推导的蛋白质序列与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、人类等物种的β-actin蛋白序列相似性均在95%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。β-actin基因在不同发育时期的线虫中持续恒量表达。由此推断中华卵索线虫β-actin基因具有高度保守性,可以作为生物物种进化的分子标志,且能较好反映物种间的系统发生关系,是量化实验的理想内标参照。 相似文献
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蜘蛛毒液中含有多种杀虫肽,因而具有较强的杀虫作用,可迅速杀死农林害虫。蜘蛛毒素肽（ω-ACTX-Hv1a,ω-ACTX-Hv2a）是从澳大利亚的多能厚爪蛛Hadronyche versuta的毒液中分离获得,对昆虫有毒但对哺乳动物无毒。本文通过将人工合成的两种蜘蛛肽基因（hv1a、hv2a）与来源于对棉铃虫具有高活性的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）野生菌株NBIC380中的杀虫基因cry1Ac进行融合并在NBIC380中表达,获得了7种不同的重组菌株BtBM-Ve（含有空表达载体）、BtBM-Ac（含有cry1Ac基因）、BtBM-1a（含有hv1a基因）、BtBM-2a（含有hv2a基因）、BtA1a（含有cry1Ac+hv1a融合基因）、BtA2a（含有cry1Ac+hv2a融合基因）和BtA（1+2）a（含有cry1Ac+hv1a+hv2a融合基因）。重组菌分别进行了棉铃虫Helicoverpa armigera 2龄幼虫、秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans和朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的生物活性测定,结果显示BtBM-Ve无杀虫增效作用,BtBM-Ac、BtBM-1a、BtBM-2a、BtA1a、BtA2a和BtA（1+2）a针对不同的虫源具有不同的杀虫增效活性,对3种害虫杀虫增效最多的重组菌是BtA（1+2）a,对棉铃虫2龄幼虫杀虫增效百分比为93.43%,对秀丽隐杆线虫为34.48%,对朱砂叶螨为13.46%。本文构建的基因工程菌对防治鳞翅目害虫、螨虫和线虫具有重要的理论意义和应用前景。 相似文献
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树栖真菌对扩散型松材线虫生活史的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
松材线虫病是一种涉及多个生物因子的复杂病害系统,其病原松材线虫的生活史受媒介昆虫、寄主、树栖真菌和伴生细菌等多种因素影响。利用感染松材线虫病的马尾松林内的两种优势内栖真菌的3个菌株,松球壳孢(Sphaeropsis sapinea)E11、MHS7.3和小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)M32,接种于松褐天牛模拟蛹室,研究松褐天牛蛹期和羽化过程松材线虫种群动态,以及松褐天牛携带扩散型松材线虫的动态变化。结果表明,天牛发育处于蛹期时,松材线虫主要以扩散型三龄幼虫(JⅢ)附着于天牛体表;发育至羽化期时,松材线虫主要以扩散型四龄幼虫(JⅣ)位于天牛体内。不同优势内栖真菌接种处理下,松褐天牛携带的扩散型幼虫数量的大小顺序为:小孢拟盘多毛孢M32>松球壳孢E11>松球壳孢MHS7.3,这与模拟蛹室中松材线虫种群的大小顺序是一致的,表明松褐天牛携带的线虫数目与蛹室中线虫种群的大小关系密切。在松褐天牛携带的JⅢ、JⅣ和扩散型幼虫(JⅢ＋JⅣ)占线虫种群比例方面,松球壳孢E11和MHS7.3均大于小孢拟盘多毛孢M32,显示不适宜繁殖的真菌能促进群体内更多个体转化为扩散型虫态。JⅣ在蛹期的第二天即从天牛体内分离得到,但数量极少,随着JⅢ在羽化前达到最大值,JⅣ也开始大量出现,预示着较大JⅢ种群数量可能是JⅣ大量发生的基础条件之一。研究结果表明在松材线虫的扩散过程中,松林优势树栖真菌对媒介天牛携带的松材线虫数量产生显著影响。 相似文献
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“发育快，交配效率高”是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。通过生物信息学分析、原位杂交和RNAi等技术，本研究明确了Bxy-egl-30在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)个体生长发育过程中的功能。生物信息学分析结果表明Bxy-egl-30编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸，属于EGL-30蛋白亚基家族。原位杂交结果显示Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段的表达具有特异性，在胚胎期与幼虫期该基因广泛表达于性腺、肠道和附近的体壁细胞等部位；在成虫期，该基因在雌虫的阴户肌肉和雄虫的性腺部位集中表达。RT-qPCR结果显示Bxy-egl-30在二龄期表达量最高，胚胎期次之，三龄期、四龄期和成虫期表达量依次降低。浸泡Bxy-egl-30双链RNA后，松材线虫胚胎的孵化率下降了10.88%,二龄期、三龄期幼虫活力明显下降，每分钟头摆频率约下降4次。致病性接种实验结果显示松材线虫被Bxy-egl-30双链RNA干扰后致病性减弱，减缓了黑松的死亡时间，干扰组黑松的死亡时间比对照组晚9 d。本研究明确了Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段... 相似文献
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昆虫在进化过程中发展出多种决定性别的调控机制。不仅不同昆虫通过不同的基因和调控机制决定性别分化，甚至在同种昆虫不同品系之间性别决定机制也不尽相同。了解昆虫性别决定分子调控机制，不仅有利于揭示昆虫性别的产生与进化，而且为昆虫的遗传操作提供理论和实践基础。本文综述了不同昆虫中的性别决定原始信号及其调控机制，介绍了昆虫性别决定底层基因doublesex和性别决定关键基因transformer、transformer-2的研究概况，以期为靶标昆虫性别决定的害虫不育防治技术提供理论支持。 相似文献
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南方根结线虫促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因的RNAi效应分析 总被引：3，自引：0，他引：3
促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在线虫的生长发育等方面具有重要作用,本研究探索利用RNAi技术沉默南方根结线虫mapk-1基因来抑制线虫的生长发育。根据mapk-1基因的cDNA序列设计引物,通过体外转录合成约550bp的dsRNA对南方根结线虫的卵进行RNAi以沉默mapk-1基因。试验结果表明,将南方根结线虫的卵块浸泡在含有2mg/mL dsRNA的M9缓冲溶液中,24h后卵块孵化出的2龄幼虫数量明显多于对照组(无dsRNA),但孵化出的幼虫死亡率高达90%,而对照组的死亡率低于5%,说明mapk-1基因的沉默抑制了卵块的孵化和线虫的生长,同时将孵化的幼虫接种番茄,14d后番茄根部无根结产生,35d后无卵块产生;而浸泡72h后卵块孵化出的2龄幼虫几乎全部死亡,并且孵化的线虫数量明显少于对照。提取导入dsRNA的卵块的RNA进行半定量PCR分析,结果表明mapk-1基因的mRNA被降解。 相似文献
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为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1（GenBank No.：ALE32751）和NlPPO2（GenBank No.：ALE32752）全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。 相似文献
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促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase)在线虫生长发育过程中具有重要作用。本研究利用RACE方法克隆了松材线虫mapk基因,其基因全长1 744 bp,5'UTR长243 bp,3'UTR长81 bp,含有一个1 098 bp的开放读码框,包括6个外显子和5个内含子,为单拷贝基因,其预测的蛋白序列与其他线虫的序列相似性为77.66%~84.01%。通过体外转录合成341 bp的dsRNA,将松材线虫的幼虫浸泡在1.5 mg·mL-1dsRNA中24 h后,mapk表达量下降约85%,松材线虫的死亡率约为对照的4.2倍,经dsRNA浸泡的成虫,繁殖能力下降约50%,表明mapk基因的沉默可能抑制松材线虫的繁殖能力。 相似文献
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根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。 相似文献
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选择合适的内参基因是采用实时定量PCR研究基因表达获得可信数据的关键。以小麦在条锈病菌及温度双因素胁迫为研究对象,采用实时荧光定量PCR评价了CDC、RLI、ACTIN和26S基因的表达情况,采用geNorm和NormFinder软件进行了比较分析。结果表明,小偃6号小麦在常温(15℃±1℃)未接种条锈病菌,以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在高温(20℃±1℃)、变温(20℃到15℃)条件处理中,基因RLI表达不稳定,基因ACTIN在常温条件下以及在条锈病菌及高温处理条件下的表达量相对稳定,但在变温条件下波动较大。表达最稳定的基因是26S,其次是CDC基因,它们可以作为小偃6号-CYR32-温度互作体系中基因表达实时荧光定量PCR研究的内参基因,26S和CDC是最佳内参基因组合。 相似文献
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建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L~(-1) IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。 相似文献
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胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。 相似文献
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保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH）是调控保幼激素（juvenile hormone,JH）滴度的重要降解酶。本文在黏虫体内克隆得到一条具有EHN环氧水解酶超家族结构域的保幼激素环氧水解酶MsJHEH2基因cDNA序列（GenBank登录号：MT802192）,长度1533 bp,开放阅读框（ORF）为1389 bp,编码462个氨基酸,推测分子量和等电点分别为52.42 kDa和7.07。表达模式分析发现,MsJHEH2在黏虫各个龄期与组织中均有表达,其中在蛹期和中肠中表达量最高。RNA干扰处理4龄幼虫6 h后的基因沉默效率最高,为64.86%,此时黏虫体内JH滴度上升为对照的1.58倍。该基因沉默后对黏虫无明显致死作用,但导致其蛹历期延长、羽化率降低。本研究表明MsJHEH2可以通过调节JH含量进而影响黏虫生长发育进程。 相似文献
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采用RT-PCR法从感染齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)贵州分离物的苋色藜叶片中扩增出病毒的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因保守序列。测序结果显示,该保守片段长516 bp,编码171个氨基酸残基。构建了该片段的原核表达载体pET32a-ORSV RdRp并转化BL21(DE3)菌株,在25℃以0.4 mmol·L-1 IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为36 kDa,与预测相符合。将该重组蛋白作为抗原免疫BABL/C小鼠,制备的多克隆抗体效价达1∶102 400。间接ELISA结果表明,该多抗具有较强的特异性,能检测到ORSV感染的病叶汁液中的RdRp,而与其它感染4种同属或不同属病毒的病叶汁液不发生血清学交叉反应,本实验为进一步研究RdRp的结构和功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定基础。 相似文献
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水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。 相似文献