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可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段? 相似文献
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葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L-1,探针终浓度为0.6 μmol·L-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。 相似文献
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葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L-1,探针终浓度为0.6 μmol·L-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。 相似文献
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长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌?根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异, 设计并合成特异性引物和探针, 建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能特异性检测长孢轮枝菌; 灵敏度试验结果表明, 最低检测限量为10 μL反应体系中总DNA含量10 pg; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.8 μmol/L, 探针终浓度0.8 μmol/L, 优化后的整个反应过程约1 h?实际样品检测结果表明, 该方法可用于疑似受长孢轮枝菌侵染的萝卜样品检测与初筛?此方法快速?灵敏, 检测过程完全闭管, 无需PCR后续处理, 为早期快速检测长孢轮枝菌提供了重要参考? 相似文献
5.
根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。 相似文献
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依据出入境检验检疫行业标准SN/T 3174-2012,对新疆口岸进境的哈萨克斯坦油葵中的向日葵黑茎病菌进行检疫鉴定。挑取油葵样品中的可疑病种子和植株残体作为实验材料,分别提取其DNA,用向日葵黑茎病菌特异性检测引物LEPB/LEPF对挑取的样品进行PCR检测初筛,初筛结果阳性者,进行病原分离培养。对分离获得的阳性纯培养菌株的菌落、孢子形态进行观察,PCR检测及致病性测定,最终确定其为向日葵黑茎病菌。本研究从进境哈萨克斯坦油葵中分离到检疫性病原菌,新疆周边口岸应进一步加强疫情监测与调查。 相似文献
7.
三重PCR检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验建立一种可同时检测黄瓜炭疽病(Colletotrichum orbiculare)、黄瓜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)和黄瓜细菌性萎蔫病(Erwinia tracheiphila)等黄瓜主要病害病原菌的三重PCR检测体系。采用正交试验设计方法, 对三重PCR的影响因素分析研究, 进行退火温度优化, 并以3个引物组、Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+ 共6因素3水平进行多重PCR体系优化, 成功建立了适合黄瓜主要病害的三重PCR最佳检测体系, 即25 μL的反应体系中含有0.24 μmol·L-1 CY1/CY2;0.72 μmol·L-1 SSFWD/SSREV;0.336 μmol·L-1 ET-P1/ ET-P2;1 U Taq聚合酶;0.15 mmol·L-1 dNTP;1 mmol·L-1 MgCl2, 最适退火温度为63℃。该方法能够快速从田间黄瓜发病植株和根围土壤中将黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌和黄瓜细菌性萎蔫病菌检测出来, 灵敏度可以达到10 pg·μL-1。 相似文献
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甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为102 copies·μL-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。 相似文献
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《植物检疫》2015,(6)
本研究根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列,向日葵黑茎病菌的ITS-5.8S r RNA基因序列,分别设计特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立同时检测这两种检疫性病菌的多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌可分别扩增出307 bp与388 bp的特异性条带,其他参照菌株及阴性对照均无条带;检测体系对混合模板中向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的DNA灵敏度均达0.05 ng/μL;且该检测方法对退火温度不敏感,适用范围广。该方法能够准确、快速的检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌,适合于口岸实验室的快速检测。 相似文献
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利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌 总被引：1，自引：0，他引：1
根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。 相似文献
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建立了土壤中芸薹根肿菌荧光定量PCR(qPCR)快速检测及风险预警体系。确定了芸薹根肿菌qPCR检测的特异性引物PbF/PbR,对根肿菌质粒DNA的检测灵敏度为1.612×10-6 ng·μL-1,比普通PCR高出1 000倍;对土壤和基质中芸薹根肿菌孢子的最低检测下限均为10 个·g-1,而土壤和基质带菌的发病阈值分别为100和1 000 个·g-1,高于该浓度时根肿病发生风险大。本研究建立的芸薹根肿菌qPCR技术体系检测下限远低于发病阈值,可以快速、准确、定量地检测出采自四川绵阳、湖北恩施、江苏无锡、山东青岛、辽宁沈阳、山西运城、内蒙古巴彦淖尔和宁夏固原等8个地区的27份田间土壤中芸薹根肿菌的数量,实现对十字花科根肿病的监测预警,为制定产前病害防控方案提供依据。 相似文献
12.
灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL-1,略低于常规PCR(10 fg·μL-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。 相似文献
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大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。 相似文献
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扁桃拟茎点霉(Phomopsis amygdali)引起的桃缢缩溃疡病是桃生产上重要的病害之一。带菌苗木及接穗是病害向无病区传播的主要途径。严格的检疫措施是保证无病区健康生产的关键。准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施及研究病害发生规律的有力工具。将扁桃拟茎点霉组蛋白H3(histone H3)基因与其近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标。针对histone H3基因为靶标,设计了特异性引物和Taq Man探针,建立了扁桃拟茎点霉的荧光定量PCR检测方法。结果发现,该方法只能特异识别扁桃拟茎点霉。检测灵敏度可达4×10~1copies·uL~(-1),比常规PCR检测方法高1 000倍;孢子检测最低限达2个孢子,比常规PCR检测方法高10倍,且仅需1 h即可完成检测。该方法用于田间样品检测,扁桃拟茎点霉的阳性检出率达86%,高于分离培养法和常规PCR检出结果。本研究建立的基于Taq Man探针的荧光定量PCR检测体系可用于田间对扁桃拟茎点霉的快速检测。 相似文献
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引起玉米穗腐病的两种镰孢菌双重PCR快速检测体系的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是引起玉米穗腐病的两种主要病原菌。为了建立这两种病原菌的快速和定量检测体系,本研究分别设计了针对F.graminearum和F.verticillioides的基因特异性引物,建立了双重PCR反应体系,并从DNA浓度、引物浓度和退火温度3个方面对反应体系进行了优化。结果表明,退火温度为54℃和58℃时扩增效果较好,DNA模版的检测灵敏度可以达到6.25 ng·μL~(-1);F.graminearum和F.verticillioides引物最佳终浓度配比为0.2μmol·L~(-1)/0.4μmol·L~(-1)。本研究建立的双重PCR对同时鉴别引起玉米穗腐病的两种主要镰孢菌提供了准确、快速、灵敏的检验检疫技术。 相似文献
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石楠叶斑病病原鉴定及对药物敏感性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
石楠(Photinia serrulata Lindl.)是华中地区一种重要的绿化树种。近年来在武汉地区石楠上发现一种新的叶斑病。本文通过组织分离法、致病性测定等从病株分离得到致病病原菌,并通过形态学鉴定、分子生物学鉴定等,最终确定该致病菌为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。在室内测定了P.microspora对7种常见杀菌剂的敏感性,结果表明,7种杀菌剂对P.microspora的菌丝生长均有抑制作用,但不同杀菌剂之间EC50值相差较大。450 g·L~(-1)咪鲜胺水剂、70%甲基托布津可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂EC50值分别为0.099、0.142和0.631μg·mL~(-1)。25%三唑酮可湿性粉剂EC50值在7种杀菌剂中最大,为37.625μg·mL~(-1)。这是国内外关于P.microspora引起石楠叶斑病的首次报道。 相似文献