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1.
[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。 相似文献
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对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。 相似文献
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猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养 总被引：2，自引：0，他引：2
为了获得高纯度的猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,对猪子宫内膜进行胶原酶消化,分离基质细胞和腺上皮细胞进行体外培养,研究其生长特性.结果表明:猪子宫内膜组织在37℃、通过1 g/L胶原酶Ⅰ消化90 min可以获得游离的腺体,对腺体进行培养时上皮细胞比例可达70％以上.培养过程中采用差速消化和差速贴壁可以成功分离腺上皮细胞和基质细胞.基质细胞最适贴壁时间为25 min,腺上皮为3h.纯化的基质细胞生长迅速,可传5代以上,上皮细胞生长缓慢,并且成片脱落. 相似文献
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孕早期家兔子宫内膜细胞的分离培养与形态观察 总被引：5，自引：2，他引：5
为探讨子宫内膜细胞的分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程,采用不同消化方法进行了孕早期家兔子宫内膜细胞的消化和分离培养试验。结果表明,多数情况下采用胰蛋白酶消化获得的细胞数量少且活率低于60%,而采用1g/L胶原酶 型消化获得的细胞数量多达1×106/cm3,且活率大于90%。经74μm(200目)滤网过滤分离培养出多角形和梭形2种形态的基质细胞及铺路石状的腺上皮细胞,并均能在体外培养和传代。 相似文献
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为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离、生长条件以及纯度鉴定,通过2 g/L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4 h,200目的滤网过滤后进行低速离心,收集沉淀物,沉降洗涤3~5次,将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养。12 h后开始贴壁生长,腺团开始向外部扩散,生长2~3 d,细胞扩散并出现明显的铺路石状,4~5 d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长。经免疫组织化学方法进行细胞染色,细胞表达角蛋白的阳性率达90%以上。 相似文献
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[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。 相似文献
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【目的】探讨输卵管上皮细胞和基质细胞的体外分离培养方法及在激素刺激下基质细胞对上皮细胞的作用。【方法】通过差速贴壁法体外分离纯化兔输卵管上皮细胞和基质细胞;免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法鉴定上皮细胞和基质细胞的类型和纯度;并在无胎牛血清的DMEM/F12培养液和含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液中,分别添加不同浓度的雌激素(17β-E2)和孕激素(P4),比较上皮细胞和基质细胞的增殖情况及其对上皮细胞/基质细胞共培养的影响。【结果】体外成功地分离到兔输卵管上皮细胞和基质细胞;兔输卵管上皮细胞经鼠抗人细胞角蛋白单克降抗体(anti-CK18)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在98%以上;兔输卵管基质细胞经鼠抗人波形蛋白单克降抗体(anti-Vimentin)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在95%以上。17β-E2和P4均能促进兔输卵管上皮细胞和基质细胞的增殖,使其数量明显增加。基质细胞与上皮细胞共培养,上皮细胞增殖较快。【结论】差速贴壁法能够获得纯度较高的输卵管上皮细胞和基质细胞,在17β-E2和P4共同作用下,少量基质细胞能促进上皮细胞生长。 相似文献
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为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法，采集奶牛蹄部真皮组织，通过组织块贴壁法和双酶消化法（胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶）分离原代奶牛真皮成纤维细胞，通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性，MTT法用于绘制细胞生长曲线，利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物，鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察，贴壁后第6天有细胞爬出，形态多呈长梭形，排列紧密呈漩涡状或束状；双酶消化组第2天有长梭形细胞生长，混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示，组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞，波形蛋白呈阳性表达，角蛋白-18呈阴性表达，表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞，与双酶消化法相比，组织块贴壁法分离的细胞纯度更高，活性更佳，增殖周期更短，提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。 相似文献
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【目的】探讨山羊腺垂体细胞的分离和培养方法,为其体外分泌特性研究奠定基础。【方法】采集山羊腺垂体,分别用胰蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶和胶原酶混合、胰蛋白酶和透明质酸酶混合对其进行消化,所获细胞培养后采用免疫细胞化学法进行鉴定,评价细胞消化结果和腺垂体细胞的生长特性。【结果】山羊腺垂体组织在37℃条件下,以1 g/LⅣ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶混合消化2.5～3 h,消化效果较好;所得细胞在培养24 h开始贴壁,72 h后细胞主要呈多角形或梭形,连接成片,培养6 d左右细胞即可铺满培养器皿的细胞生长面。免疫细胞化学鉴定结果显示,FSH阳性细胞胞质呈蓝色,PRL阳性细胞胞质呈蓝褐色;放射免疫分析法测定表明,分离、培养的腺垂体细胞具有激素分泌活性。【结论】采用筛选的消化和分离方法可获得山羊腺垂体细胞,所获腺垂体细胞体外培养体系,可用于体外研究腺垂体细胞的功能和内分泌调控作用。 相似文献
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[Objective] The experiment aimed to set up a method for isolating and culturing endometrial stromal cells (BESC) and endometrial glandular epithelial cells(BEGEC) of buffalo as well as laid foundation for studying biological mechanism of embryo implantation and uterine diseases. [Method] The enzymatic digestion method, scraping method, serial filtration and differential velocity adherent technique were used to isolate BESC and BEGEC, then immunocytochemical method and TRYPAN-Blue assay were used to determine the purity and survival rate of isolated cells. [Result] The BESC and BEGEC were successfully isolated and cultured while immunocytochemical method and cell count method demonstrated that the purity was over 90%. The result of TRYPAN-Blue assay shown that survival rate of BESC and BEGEC was 91% and 78% respectively. [Conclusion] The enzymatic digestion method, scraping method, serial filtration and differential velocity adherent technique could isolate BESC and BEGEC with high purity. 相似文献
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为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,至10代山羊小肠上皮细胞质变大,细胞几乎无法增殖,细胞开始凋亡。综上所述,采用组织块接种能够获得山羊小肠上皮细胞并正常传至第10代,可为研究山羊小肠上皮细胞营养物质吸收和调控机理提供细胞素材。 相似文献
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安淮山羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了分离得到安淮山羊骨骼肌卫星细胞,成功构建山羊骨骼肌卫星细胞系,为相关研究提供实验材料。以安淮山羊背最长肌肌肉组织为材料,采取胶原酶和胰蛋白酶结合的二步消化法,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞。对骨骼肌卫星细胞中特异性基因Pax7用免疫荧光染色法及PCR扩增加以鉴定。通过分离、纯化,得到纯度较高的山羊骨骼肌卫星细胞,其形态为圆形,折光性强。培养一段时间后密度增大,细胞呈梭型。所得骨骼肌卫星细胞生长状态良好,具有较为一致的生长方式和形态特点。经免疫荧光染色法以及PCR鉴定发现细胞系中有Pax7基因的表达。通过上述材料和方法,可获得较纯的山羊骨骼肌卫星细胞,并稳定传代。 相似文献
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【目的】观察发情周期不同阶段牦牛子宫中ERα、PR mRNA和蛋白的表达变化。【方法】采用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学SP法分别对发情期、发情后期、间情期和发情前期牦牛子宫中ERα和PR mRNA及ERα和PR蛋白的表达特点进行了研究。【结果】发情周期不同阶段牦牛子宫内膜和肌层中均有ERα mRNA和 PR mRNA的表达,ERα和PR蛋白免疫阳性产物表达于子宫腔上皮细胞、腺上皮细胞、基质细胞、血管内皮细胞和子宫肌层平滑肌细胞中;子宫内膜中ERα mRNA和PR mRNA在发情后期表达最强,间情期显著下降（P＜0.05）,发情前期回升;ERα和PR蛋白表达在发情期最强而间情期最弱;子宫肌层中ERα mRNA和PR mRNA的表达在发情期较高,发情后期显著下降（P＜0.05）,间情期降到最低,发情前期显著回升（P＜0.05）,且达到最高值;ERα和PR蛋白发情期表达最强,间情期最弱,但其间无显著差异（P＞0.05）。【结论】ERα和PR在牦牛子宫内膜和肌层中随发情周期不同呈周期性变化,参与调节发情周期不同阶段牦牛子宫内膜及肌层功能的发挥。 相似文献
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用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织。获取兔泪腺上皮细胞，设计相应的培养基，进行组织块原代培养或混合消化原代培养，用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明。组织块在体外培养10d，可见上皮样细胞从植块边缘长出，2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层，经传代3次，角蛋白染色阳性细胞纯度达90％以上；用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示：用剪切组织块进行培养的方法简便易行，易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。 相似文献
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猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。 相似文献
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体外培养的牛乳腺上皮细胞形态研究 总被引：7，自引：0，他引：7
通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。 相似文献
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鸡胚肺动脉内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
探索简单快速实用的鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养方法:在严格无菌条件下对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分离培养,待细胞融合度达约80%时进行传代,得到的内皮细胞利用差速消化法纯化,并观察2种细胞形态特征及培养特性,待细胞稳定生长后,采用荧光免疫组化技术鉴定细胞,并进行冻存和复苏,观察复苏后细胞活性。结果显示:24 h后组织块周围即有少量细胞爬出,内皮细胞大量生长后呈突起状排列,立体感强,平滑肌细胞在培养后的第5天呈现"峰谷"样外观,经免疫荧光法证明是内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,冻存于液氮中1~2个月复苏后细胞的活性都较好,可以恢复旺盛生长。结论:本研究提出的组织贴块法能成功获得内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,比酶消化法操作简单,更适合小血管内皮细胞、平滑肌细胞的原代培养。 相似文献