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1.
黄鳝生长激素基因cDNA的克隆及胞内真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为大量获得具有生物学活性的黄鳝生长激素,采用RT-PCR的方法从黄鳝脑cDNA中扩增得到了黄鳝生长激素基因。通过特异性的引物扩增后,将黄鳝生长激素基因ORF区域序列连接到酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—rfeGH。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母GS115。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌,序列测定表明生长素基因已经成功的转移到酵母基因上。黄鳝生长激素胞内表达载体的构建成功为进一步研究黄鳝生长激素基因的功能和大量开发并利用奠定了实验基础。 相似文献
2.
根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279 bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验... 相似文献
3.
《江西农业学报》2022,(2)
根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。 相似文献
4.
将青麻epsps基因构建到酵母胞内表达载体pPIC3.5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,PCR技术筛选出阳性转化子,证明外源epsps基因已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,经诱导表达后SDS-PAGE分析获知外源基因在酵母中获得了表达。并且通过草甘膦压力筛选出耐性较好的重组酵母菌株,证明所获得的epsps基因具有生物学功能。 相似文献
5.
《江西农业学报》2017,(2)
根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。 相似文献
6.
为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。 相似文献
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大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。 相似文献
8.
牛乳铁蛋白多肽的合成及抗菌活性试验 总被引：1，自引：0，他引：1
用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段.合成片段与酵母表达载体DPICZα A重组,构建胞外分泌表达载体pPICZα A-LfcinB,通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB,诱导表达6 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽基因已整合剑酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较高抗菌活性的抗菌肽,表达产物具有较强杀菌作用. 相似文献
9.
采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。 相似文献
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以已构建的含有小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的重组质粒pGEM-XYGluD3-LMWGS1为模板,利用设计的序列特异引物,扩增基因XYGluD3-LMWGS1编码区,构建成巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-XYGluD3-LMWGS,将其线性化后用电激法导入甲醇型酵母（Pichia.pastoris）菌株GS115中;利用pPIC3.5K特征引物进行PCR鉴定,筛选得到重组转化子,将重组转化子进行蛋白诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,XYGluD3-LMWGS1基因未能在毕赤酵母中成功表达。 相似文献
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为获得Eno的重组蛋白,采用PCR法从金黄色葡萄球菌wood46株基因组扩增eno基因,并连接到pMD18-T载体上,转化至BL21感受态细胞中;重组质粒经PCR及酶切鉴定后,送上海生工测序。将鉴定正确的质粒酶切回收产物与原核表达载体pET-32a连接,然后转化至BL21感受态细胞,对平板筛选的阳性质粒进行PCR和酶切鉴定。对鉴定正确的重组菌进行诱导表达并纯化。实验结果表明成功构建了pET32a-eno表达载体,并获得了该纯化蛋白。该实验结果为S.aureus亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。 相似文献
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参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示:表达产物分子质量为38 ku,以包涵体的形式存在,表达产物用His亲和层析柱进行纯化。Western blotting分析表明:该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应。结果证明该表达产物具有生物学活性,可作为鉴别诊断的抗原。 相似文献
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[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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克隆大豆油体蛋白特异启动子及油体蛋白基因的全长序列,利用连接PCR的方法,通过一个肠肽酶位点将人成骨蛋白成熟肽编码序列连接到油体蛋白基因3'端并克隆到表达载体pCAMBIA1302中,构建"油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白"植物表达载体.通过酶切、PCR和测序鉴定,证明表达载体构建成功,将其命名为pCAM-oleo-Bmp7.通过蛋白分析软件DNAstar、SignalP3.0和ProtComp v8.0等软件对重组蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和细胞定位进行了分析和预测,证明融合蛋白很好的保留了原来两个蛋白的二级结构和理化性质. 相似文献
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根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达. 相似文献