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绵羊毛发角蛋白结合蛋白启动子的克隆与活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以绵羊基因组DNA为模板克隆获得绵羊角蛋白结合蛋白基因KAP6.1启动子。将KAP6.1启动子插入到切除了CMV启动子的pAcGFP1-N1质粒中,构建了重组真核表达载体,并采用脂质体法转染传代培养绵羊皮肤成纤维细胞并检测其表达活性。结果显示：（1）KAP6.1启动子序列大小为830 bp,与GenBank上绵羊角蛋白结合蛋白的参照序列（M95719）有99.64%的同源性;与M95719相比,KAP6.1在349位点、726位点和246位点上分别存在1个C缺失、1个转换（G代替A）和1个颠换（A代替T）;在438位点上具有1个依赖DNA的RNA聚合酶结合位点TATA box,但未发现具有依赖DNA的RNA聚合酶识别位点CAAT box;（2）转染24 h后,在蓝光激发下检测到细胞核附近有绿色荧光蛋白的高表达,并在48 h后逐渐减弱,而细胞质内绿色荧光蛋白的表达量增加。这一结果表明,KAP6.1启动子在绵羊皮肤成纤维细胞的表达上可能具有特异性。 相似文献
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《中国畜牧杂志》2015,(23)
本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。 相似文献
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草地藏系绵羊生长激素基因的克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
从草地藏系绵羊垂体中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得长度为650bp左右的片段,连接到PMD-18T载体上,转化到Top10感受态细胞中培养,经蓝白斑筛选,挑取阳性克隆子测序.结果显示,所得片段为草地藏系绵羊生长激素(GH)cDNA,与其它绵羊品种GH 序列比较同源性为99.69%;与人、牛、山羊、大鼠、小鼠的同源性分别为75.45%、97.68%、99.08%、84.49%、83.87%,由序列推测的草地藏系绵羊GH氨基酸序列与其它绵羊品种一致,与其近缘种山羊亦无差异,与牛GH氨基酸序列同源性为99.08%. 相似文献
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试验根据原鸽雌性特异性序列AY944219设计引物,用PCR法分别扩增肉鸽和信鸽雌性特异性序列,并克隆测序。结果在肉鸽和信鸽分别克隆出长度为191bp的片段,且证实两个片段亦是雌性特有。把克隆测序获得的两段序列与GenBank上原鸽的序列（AY944219）进行两两比对,发现肉鸽与原鸽的同源性为98％,信鸽与原鸽的同源性为96％,而肉鸽与信鸽的同源性为97％。 相似文献
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采用PCR技术扩增出济宁青山羊催乳素受体基因长892 bp的片段，该片段含有97 bp的部分外显子8序列（外显子8全长为100 bp）、683 bp的内含子8、70 bp的外显子9及42 bp的部分内含子9。将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。该序列与绵羊、母牛、人、大鼠、小鼠的催乳素受体基因mRNA的对应序列的核苷酸同源性分别为99.4 %、97.01%、89.22%、89.22%、88.02%，氨基酸同源性分别为100%、94.55%、81.88%、81.82%、83.64%。 相似文献
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目的,克隆新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因片段。方法,以新疆地区绵羊种布鲁氏菌(80/019)菌株的基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增基因片段,通过T4DNA连接酶将扩增基因片段连接于PBS-T克隆载体上,酶切鉴定、测序、分析。结果,通过PCR技术扩增的Omp31基因片段为723bp,该片段与国际标准菌株绵羊种核苷酸序列相比同源性达98.76﹪,与国际标准菌株犬种核苷酸序列相比同源性达99.86﹪,与国际标准菌株猪种、海洋种核苷酸序列完全相同。结论,获得的目的基因与文献报的基因序列基本一致,但有一定差异。其同源性很高,为进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白的免疫特性及开发基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(1)
为了解角蛋白关联蛋白(KAP)24.1基因在新吉细毛羊群体中的多态性与其毛用性状的关联性,试验采用DNA测序法对新吉细毛羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCRSSCP技术对497只新吉细毛羊KAP24.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与产毛量、纤维直径、拉伸长度进行关联性分析。结果表明:在编码区有两处突变点,一处在348 bp处发生C→T的突变,脯氨酸突变为亮氨酸;另一处在414 bp处发生T→C的突变,丝氨酸突变为脯氨酸,均属于错义突变,KAP24.1基因的AA、AB、BB和CC基因型与纤维直径不相关(P0.05),BB基因型的产毛量和拉伸长度显著大于AB基因型、CC基因型(P0.05)。说明KAP24.1基因可以作为新吉细毛羊产毛量和拉伸长度主要候选基因之一,BB基因型可以作为分子标记用于预测绵羊产毛量和拉伸长度。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2015,(12)
本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574bp,其中ORF区192bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3′UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。 相似文献
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细毛羊黑素皮质激素受体1(MC1R)基因与毛色表型的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究黑素皮质激素受体1(MC1R)基因与黑色素生成的关系及该基因突变导致毛色发生改变的机理,研究采用RT-PCR和PCR等技术克隆得到了白色东北细毛羊MC1R基因长1 093 bp的cDNA片段,编码364个氨基酸,其中包括70个氨基酸信号肽和294个氨基酸的成熟肽,具有7个跨膜结构域。结果表明:细毛羊cDNA与绵羊、牛、马、人、小鼠、犬等同源性均大于91%,氨基酸序列与其他动物的同源性高于89%;除绵羊外与其他动物相比有5处发生突变,且这5处突变均位于MC1R蛋白跨膜结构区;而细毛羊和绵羊之间只有1处发生突变,由K→M,同源性达98.97%。说明细毛羊与绵羊的亲缘关系最近。 相似文献
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为了克隆绵羊血管内皮生长因子A(VEGF-A)基因,探寻该基因与绵羊毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,试验采用RT-PCR方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-A基因mRNA并对其进行生物信息学分析。结果表明:以皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增出3条特异性条带;克隆测序结果显示所有条带均为VEGF-A基因序列,片段长度依次为828,825,756,624 bp。828 bp和825 bp片段属于全长VEGF-A,其中825 bp片段在3′非编码区缺失3个碱基;756 bp和624 bp片段由可变剪切产生,分别为外显子6缺失和外显子6,7双缺失,编码蛋白与人类VEGF-A165和VEGF-A121类似;核苷酸序列比对发现,VEGF-A基因mRNA仅存在3个SNP位点;蛋白结构域分析发现,三种类型VEGF-A蛋白均含有完整的血小板衍生生长因子(PDGF)结构域。说明试验成功地从绵羊皮肤组织中克隆到VEGF-A基因并证实可变剪切突变体的存在。 相似文献
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本试验旨在研究青海半细毛羊白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)基因分子进化情况,对IL-8基因进行了克隆及序列分析。根据GenBank公布的羊IL-8基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增目的片段,将目的基因与pMD18-T克隆载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对PCR与酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,采用生物信息学软件对IL-8基因序列进行序列分析。结果表明,羊外周血淋巴细胞中扩增出与预期大小(370 bp)相符的条带,同源性分析结果显示,克隆的核苷酸序列与已知IL-8基因序列同源性为96.1%~99.0%,是较为保守的基因。 相似文献
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TAC1基因在哺乳动物神经系统中广泛表达,其编码蛋白参与季节性生殖活动的调节。该研究对杜泊羊速激肽(Tachykinin,TK)基因序列进行了克隆及生物信息学分析。结果表明:克隆出杜泊羊TAC1基因组序列,得到3个克隆片段。通过生物信息学分析,克隆片段一的长度为860 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达93%,基因片段缺失4%;克隆片段二的长度为881 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达100%,没有基因片段的缺失;克隆片段三的长度为846 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达98%,没有基因片段的缺失,但有3个突变位点,分别为位于85 bp处的G/C突变、位于88 bp处和629 bp处的G/A突变、位于108 bp处和290 bp处的T/C突变。杜泊羊TAC1基因开放阅读框全长423 bp,共编码140个氨基酸。与Gen Bank已发表的其他动物TAC1基因参考序列进行比较,结果显示杜泊羊与绵羊、瘤牛、野猪、猕猴、人和大熊猫的TAC1基因同源性分别为98.9%、97.3%、88.1%、85.8%、85.0%、84.5%。通过蛋白质结构预测,发现杜泊羊TAC1基因编码蛋白没有跨膜结构域。 相似文献
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本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。 相似文献
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本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7,KAP7）基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1：10 000。 相似文献
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对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。 相似文献
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旨在克隆绵羊Gfrα1基因序列,深入研究绵羊精原干细胞(SSCs)。本研究通过RT-PCR扩增和分子克隆的方法克隆到了绵羊Gfrα1基因的编码区大部分片段。结果,克隆得到的绵羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列长1 312bp,包括1 311bp的开放阅读框(ORF),编码437个氨基酸,与牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相应核苷酸序列的同源性分别为98.5%、91.3%、91.0%、88.9%和88.0%。根据获得的cDNA序列,预测已知片段的抗原表位区,并将抗原表位区序列插入pET-44a(+)载体,经转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,并通过亲和柱层析,纯化制备GFRα1抗原表位多肽。Western blot检测发现,经诱导表达的GFRα1抗原表位多肽约为18.2ku,与预测的大小一致。绵羊Gfrα1基因的克隆和表达研究,为进一步制作该基因的多克隆抗体奠定基础,为绵羊SSCs的分子水平鉴定及功能分析提供了研究条件。 相似文献
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利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。 相似文献
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试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。 相似文献