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1.
《中国家禽》2018,(23)
研究对鸡Hsp60基因进行了扩增以及原核与真核表达载体构建。构建的原核表达载体GST-HSP60经IPTG诱导,SDS-PAGE分析获得了Hsp60的融合表达蛋白。采用纯化的GST-HSP60蛋白免疫小鼠制备抗Hsp60多克隆抗体。Western blot以及间接免疫荧光分析证明,所制备的抗Hsp60多克隆抗体不仅能识别转染真核表达载体pcDNA3.1-Hsp60表达的外源性鸡源Hsp60蛋白,而且能有效识别内源性鸡源以及人源的Hsp60蛋白。这些Hsp60基因表达载体的构建以及抗Hsp60蛋白特异性多克隆抗体的制备为进一步研究Hsp60生物学功能及其在家禽疫病中的潜在作用奠定了基础。 相似文献
2.
为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。 相似文献
3.
研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体,以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆;用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示：原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中;获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4H6和1G9;单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白,而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明,单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好,能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。 相似文献
4.
5.
研究首先对血清8型禽腺病毒(FAd V-8)的纤突蛋白基因F进行了克隆并分别构建了原核表达载体和真核表达载体,经测序验证后分别命名为p GEX-6P-1-F和pc DNA3.1-F。将原核表达质粒pGEX-6P-1-F转化BL21,经IPTG诱导,获得了FAd V-8 F蛋白的GST-F可溶性融合表达产物。将纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体。Western blot结果证明,制备的抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体能特异性地识别转染pc DNA3.1-F或感染FAd V-8病毒细胞中57 ku大小的蛋白条带。间接免疫荧光试验同样证明,抗FAd V-8的F蛋白的多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。研究结果为进一步建立FAd V-8快速血清学诊断方法、亚单位疫苗研制及探究纤突蛋白F在病毒感染致病中作用奠定了基础。 相似文献
6.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(11)
HBK鸭是国家禽类实验动物种子中心培育的我国首个无特定病原体(SPF)鸭,已封闭饲养9个世代。鸭抗原处理相关转运体(TAP)基因位于主要组织相容性复合体区域,TAP1和TAP2组成的二聚体具有将抗原肽从细胞质转运入内质网腔的重要作用。为了表达鸭抗原相关转运体蛋白,并制备特异性多克隆抗体,试验采用PCR方法扩增HBKB系鸭的TAP1完整基因和TAP2基因的预测肽结合区(PBD),分别命名为TAP1和TAP2PBD,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒p ET-TAP1和p ET-TAP2PBD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDSPAGE及Western-blot鉴定,表达产物经SDS-PAGE后分别切胶免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明:两种目的蛋白均获得了正确表达。说明试验制备了高特异性鸭TAP1和TAP2多克隆抗体,可用于水禽TAP的结构和功能研究。 相似文献
7.
构建SPRN重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备,提取BALB/c小鼠全血基因组,PCR扩增SPRN基因,克隆至融合表达载体,在大肠埃希菌中表达鼠Shadoo蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,并检测抗体效价,用Western blot方法分别检测与重组及内源性Shadoo蛋白的反应性.结果表明,成功制备了小鼠Shadoo蛋白兔源多克隆抗体,为研究Shadoo蛋白与PrP蛋白之间的功能调节关系,自身的生理学作用以及Shadoo蛋白在传染性海绵状脑病发病机制过程中的生物学功能奠定了良好的基础. 相似文献
8.
为了制备鸡干扰素调节因子7(interferon regulatory fator 7,IRF7)抗体,本研究通过分离鸡的外周血淋巴细胞,抽提RNA并反转录获得鸡淋巴细胞c DNA,利用聚合酶链式反应扩增获得鸡IRF7基因(ch IRF7),将该基因克隆入原核表达载体p COLD-TF中,构建成p COLD-TF-ch IRF7原核表达质粒。将测序正确的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经0.25 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导20 h。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得高效表达,大小为107 k Da。切胶免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗鸡IRF7多克隆抗体。激光共聚焦、Western blot实验结果显示,该抗鸡IRF7多克隆抗体能与真核质粒表达的ch IRF7蛋白发生特异性反应。该抗体的成功制备为进一步研究鸡IRF7的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
9.
为初步鉴定鸡补体受体2（ChCR2）基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1 113 bp的ChCR2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温（16 ℃）诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512 000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。 相似文献
10.
《中国畜牧兽医》2020,(1)
为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1 113 bp的ChCR2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温(16℃)诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512 000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。 相似文献
11.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(13)
为了研究鸡CD40L作为分子免疫佐剂的免疫原性,试验采用鸡的脾脏细胞克隆鸡CD40L基因,构建表达载体pET28a-cCD40L进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫长耳白兔,获得兔抗鸡CD40L多克隆抗体,用间接ELISA检测多克隆抗体效价,并进行Western-blot检测。结果表明:获得分子质量为26 ku的重组融合蛋白,多克隆抗体效价为1∶12 800;表达的融合蛋白不仅能与鼠抗His克隆抗体发生特异性反应,而且与获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体发生特异性反应。说明鸡CD40L融合蛋白具有较高的反应活性,所获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体具有良好的特异性。 相似文献
12.
猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。 相似文献
13.
为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。 相似文献
14.
为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。 相似文献
15.
《畜牧兽医学报》2017,(3)
本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。 相似文献
16.
利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。 相似文献
17.
猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。 相似文献
18.
克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。 相似文献
19.
[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。 相似文献
20.
《中国家禽》2021,(7)
为构建Ⅱ型鸡星状病毒衣壳蛋白昆虫细胞表达载体,并免疫小鼠制备多克隆抗体,研究根据病毒衣壳蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR扩增衣壳蛋白基因全长,亚克隆至杆状病毒转移载体p Fast-Bac-HTA,经过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒r Bacmid-cap,将鉴定正确的阳性质粒转染至昆虫Sf9细胞获得重组杆状病毒。Western-blot和间接免疫荧光检测结果表明,Ⅱ型鸡星状病毒衣壳蛋白在昆虫Sf9细胞中成功表达,利用表达衣壳蛋白的昆虫细胞免疫小鼠制备的多克隆抗体血清与天然病毒也具有良好的反应性。试验结果为进一步研究鸡星状病毒衣壳蛋白的生物学功能以及病毒检测方法的建立提供了生物材料。 相似文献