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1.
采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。 相似文献
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利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。 相似文献
3.
以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了981 bp的Vp7基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,构建出克隆质粒pGEM-T-Vp7。以SacⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp7及双标记表达载体pW425et,并将纯化的Vp7基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp7。将pW425et-Vp7转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态Escherichia coliX13中,经生长功能弥补筛选阳性克隆和SDS-PAGE分析,可见约40 kD的融合蛋白。Western blot分析表明该蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。 相似文献
4.
[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础. 相似文献
7.
为提高紫花苜蓿的抗根腐病性能,采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,双酶切重组MsChi-pMD18-T质粒和表达载体PCAMBIA1302后,将MsChiⅠ基因与线性表达载体PCAMBIA1302进行定向连接,通过酶切和PCR验证MsChi-pCAMBIA1302载体构建正确性.采用快速冻融法,将表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404中,转化烟草植株,对转化后的烟草植株进行PCR和RT-PCR检测.结果表明:成功构建Ⅰ类几丁质酶基因MsChiⅠ的植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,转化获得6株烟草转基因植株,目的基因已经成功整合到烟草的基因组中. 相似文献
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[目的]构建抗潮霉素标记基因的雪莲抗寒SiPEBP基因植物表达载体,转化新疆粳稻,为提高水稻的抗寒性奠定基础.[方法]用PCR方法扩增目的基因,连接到pMD19-T Vector载体上,测序验证,经BamHⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到pMDC32表达载体上,通过冻融法将该载体导入根癌农杆菌EHA105中,通过根癌农杆菌介导法转化新疆粳稻品种秋田小町.[结果]得到抗寒基因SiPEBP,并构建成SiPEBP植物表达载体.获得了具有潮霉素抗性的水稻愈伤组织,经PCR技术鉴定,目的基因已整合到水稻基因组中.[结论]获得了转雪莲抗寒SiPEBP基因的水稻植株,这对深入研究该基因在水稻中的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础. 相似文献
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为获得含有天花粉蛋白（ TCS）的转基因欧美杨108植株,进行了植物表达载体的构建以及导入欧美杨108的研究。将北京大学惠赠的含有TCS启动子及结构基因的质粒pT1-3经SacⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样双酶切的载体pCambia1301用T4 DNA连接酶相连,转化大肠杆菌,构建植物表达载体pC-tPro-TCS。将构建的植物表达载体转入农杆菌LBA4404,采用农杆菌介导法,将其导入欧美杨108中。结果表明,共得到18个潮霉素抗性愈伤和抗性芽,转化效率为4．3％。抗性体经PCR和PCR-Southern检测,初步确认TCS基因已经导入到欧美杨108中。 相似文献
11.
以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒. 相似文献
12.
[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达. 相似文献
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以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。 相似文献
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采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代. 相似文献
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柽柳类锌指基因ThZFL酵母诱饵表达载体的构建及其表达验证 总被引：2，自引：1，他引：1
利用PCR技术从柽柳cDNA文库中克隆出ThZFL目的基因序列,连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,经检验后提取质粒,用BamH I和EcoR I限制性内切酶双酶切pMD18-T-ThZFL载体和pG-BKT7-BD空载体,并将酶切产物胶回收后,用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态... 相似文献
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天蚕素类杂合肽cecropinA-magainin突变体的合成以及在毕赤酵母中的分泌表达 总被引：1，自引：1，他引：0
根据天蚕素类抗菌肽作用机制假说,设计引物对前期构建成功的载体天蚕素类杂合肽cecropinA-magainin进行定点突变,使其生成杂合肽的衍生物,测序正确后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子质量约119ku的cecA-mag杂合抗菌肽突变体获得表达,并通过琼脂扩散试验对表达产物的抑菌活性与cecA-mag进行了比较。结果表明,突变体对金黄色葡萄球菌抑菌活性比cecA-mag提高了1.2倍。 相似文献
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根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达. 相似文献
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从病牛血液中提取总RNA,根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计合成1对引物,通过RT—PCR技术扩增出牛瑟氏泰勒虫HSP70基因,并将该基因克隆到pMD18-TSimple载体上,经PCR鉴定和EcoR工、Sal工双酶切鉴定为阳性的重组质粒测定及分析结果表明,该片段长1966bp,编码620个氨基酸残基．同源性分析表明,该序列与牛瑟氏泰勒虫HSP70基因同源性为95．78％． 相似文献
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以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1). 相似文献