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反义PSY基因植物表达载体的构建及其对中国水仙的转化 总被引：7，自引：0，他引：7
实验从中国水仙花瓣中分离得到该基因的572bp的片段，将该片段反向连接到pCAMBIA1301双元载体质粒上，得到CaMV 35S组成型启动子的表达载体pCAM35S-PSY，用“冻融法”将pCAM35S-PSY质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中。PCR扩增和酶切鉴定结果表明，所构建的反义表达载体pCAM35S-PSY是正确的并已经成功导入农杆菌中。随后，按照业已建立的遗传转化体系对中国水仙进行了遗传转化，得到了转基因抗性芽。 相似文献
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欧美杨107木质素生物合成酶CCR基因的克隆及其鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
木质素作为草类饲料消化性的限制因子,直接影响饲料的利用率,而CCR是木质素生物合成关键酶之一。从正在分化的2a生欧美杨107次生木质部RT-PCR扩增出的基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明该扩增片段长为961bp,含一个编码301氨基酸的完整开放阅读框,其核苷酸序列与Leple等发表的白杨杂种Populus trichocarpa CCR的cDNA序列(AJ224986)同源性达到98.2%,并且反向插入到pMD20-T载体,因此构建了CCR的反义大肠杆菌表达载体,为后续的基因操作打下基础。该基因序列已提交国际核苷酸序列库,登录号为AM921698。 相似文献
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根据毛果杨全序列（AC185363.2）中唯一具有转移酶功能的保守区设计引物,以正在分化的2年生欧美杨107次生木质部总RNA为模板经RT-PCR扩增出hct基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为709bp,包含一个708bp的开放阅读框,与毛果杨全序列及HCT2（EU603314）的同源性均为98%,编码的氨基酸序列与毛果杨HCT2氨基酸（ACC63883.1）的同源性为98%,断定我们克隆的cDNA为hct,属于转移酶超家族,GenBank登录号为FM202091,该重组质粒命名为pMD20-T-hct。 相似文献
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《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2010,(11)
以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。经质粒PCR和双酶切分析,确定获得了pBI—4CLp—a4CL—aCAD反义植物表达载体。 相似文献
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磷脂酰肌醇合成酶PIS基因植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
磷脂酰肌醇(PI)是真核细胞中主要的磷脂组分,磷脂酰肌醇合成酶(PIS)是磷脂酰肌醇合成途径中的关键酶,它的功能是催化myo-肌醇和CDP-DG反应产生磷脂酰肌醇。将玉米PIS基因与载体pCAMBIA2300-35s连接,得到植物表达载体pCAMBIA2300-35s-PIS,该载体带有CaMV35s启动子、PIS基因、终止序列及一个CaMV35s启动子启动的NPTⅡ抗性筛选基因。将构建好的PIS植物表达载体转入农杆菌中,用于将来国槐等木本植物的转化。 相似文献
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[目的]分别构建84K杨的微管蛋白TUA5和TUB16与红色荧光蛋白mCherry融合的植物过表达载体,瞬时表达验证载体在植物体内表达后的荧光信号,为研究杨树微管功能奠定基础。[方法]以毛果杨微管蛋白TUA5和TUB16的基因序列为模板,设计84K杨的皿5和7TZB76基因的引物,提取野生型84K杨的RNA并反转录成cDNA,同源克隆得到84KTUA5和84KTUB16基因,分别连接在pCAMBIA 1300载体mCh-ep荧光标签的N,端和C端,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定获得阳性单克隆,并通过电击法将重组质粒转化到农杆菌GV3101中,瞬时转化烟草后进行荧光观察。[结果]克隆得到了84KTUA5和84KTUB16基因,成功与pCAMBIA 1300-mCherry载体连接,烟草瞬时表达荧光观察结果显示:仅目的基因与mCherry标签C,端相连的融合蛋白能够成功表达,且荧光明显。[结论]成功构建了84K杨皿5和TUB16基因与pCAMBIA 1300-mCherry的融合表达载体,为进一步研究杨树微管功能提供了背景材料。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因具有对鳞翅目昆虫的毒杀作用,因此被广泛用于转基因研究,以提高植物的抗虫能力.故以含有CryIA(b)基因的PKUB质粒为模板,利用PCR技术克隆出抗虫基因[CryIA(b)],将其构建到PGEMT-Easy上,获得重组质粒PGEMT-CryIA(b),并测定全部序列,将PGEMT-CryIA(b)用BamHI 和SmaI酶切后插入表达载体PBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成准备用于丽江云杉等针叶树种遗传转化CryIA(b)基因的植物表达载体PBI-CryIA(b),采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌LBA4404和C58中,为下一步的转化工作奠定了基础. 相似文献
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为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。 相似文献
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利用简并引物RT—PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX—AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101（含辅助质粒pJICSa—rep）侵染烟草。40d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明：从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。 相似文献
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以我国重要的生物能源灌木--中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段.在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88%,位于fad2基因编码区中部.将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株.初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10.3%. 相似文献
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采用中国林科院林业研究所生物技术室开发的核酸序列分析软件tRNASYSTEM分析了4000个杨树形成层基因氨基酸的三联体遗传密码,得出了一套适合于在杨树形成层高效表达的密码子,并通过该密码子,对从苏云金芽孢杆菌菌株Bt.886中克隆的、具有抗天牛作用的cry A基因进行了改造.在两端加上合适的酶切位点后,人工合成了最长为90bp的小片段,再经PCR延伸及T4连接酶拼接成全长为1812bp的基因.利用两端设计的酶切位点,将全长基因克隆到克隆载体PUC119上,为进一步用于在杨树形成层特异表达的研究打下了基础. 相似文献
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将来自Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki的杀虫基因cryIAc通过综合质粒载体pEG601,整合到松树共生细菌B.cereus(Bc752)的染色体上,得到的工程菌对马尾松毛虫幼虫有明显的杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达BtcryIAc基因的强启动子、cryIAc杀虫基因、四环素抗性标记基因tetr、8.0kb的EcoRI-NcoⅠB.cereus(O147)染色体片段。将综合质粒通过电击导入Bc752中,综合质粒与Bc752染色体发生同源重组,将BtcryIAc基因整合到Bc752的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析、PCR扩增、SDS-PAGE凝胶电泳检测、Westernblot、电镜观察、毒力测定,结果表明BtcryIAc基因已经整合到松树共生细菌Bc752的染色体上,并可高效表达。 相似文献
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欧美杨107次生木质部纤维素合酶基因片段的克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以欧美杨107次生木质部为材料提取总RNA,克隆得到了一个纤维素合酶基因片段.序列分析表明:该基因序列为883bp,与Populus tremula×Populus tremuloides木质部特异性纤维素合酶基因CesAl和Populus×canescen纤维素合酶基因的相似性均达到99%,与Populus tremuloides木质部特异性纤维素合酶基因Cex43的相似性达到98%.此片段拟表达的氨基酸序列具有纤维素合酶共有的锌指结构和一个不完全的高突变区,证明此DNA片段是纤维素合酶基因的片段,构建了重组质粒,并命名为pMD20-T-CesA1. 相似文献
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为了分离与鉴定巨龙竹速生巨大相关基因,以巨龙竹当年所发新叶为材料,用植物叶RNA抽提试剂盒提取了总RNA;采用C reatorTMSM ARTIMcDNA L ibrary construction k it所提供的方法,合成及纯化cDNA,并将cDNA连接到质粒载体上,通过C aC l2法将重组质粒转化到DH 5a中,成功构建了巨龙竹cDNA文库。文库容量为1.04×105,PCR检测表明大多数插入片段均大于1 000 bp,表明构建的巨龙竹cDNA文库质量较高,为进一步进行EST测序和全长基因克隆打下了基础。 相似文献
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杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域. 相似文献
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[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。 相似文献