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为了研究水稻Os CERK2基因的功能,构建了Os CERK2基因过表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株,经多代筛选和分子检测,获得了4个超量表达的过表达纯系和2个转录水平下降的RNAi纯系。转基因植株经病原微生物细胞壁成分喷雾处理,采用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中病程相关(PR)基因的表达情况,结果发现,诱导后过表达植株中PR基因表达增强,而RNAi植株中表达下降;抗病性鉴定结果表明,过表达转基因植株对白叶枯菌致病小种PXO99的抗性增强,而RNAi植株与野生型差异不显著。结果表明,过量表达Os CERK2基因可能是水稻抗病的有效途径。 相似文献
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【目的】研究飞蝗（Locusta migratoria）细胞色素P450（CYP450）第四家族（CYP4）中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1（GenBank登录号： KF857162、KF857163和KF857164）。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力,通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30,同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp,编码506个氨基酸;CYP4C73开放阅读框1 521 bp,编码 507个氨基酸;CYP4DH1开放阅读框1 512 bp,编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析,发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高;不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰,发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量,分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,这些基因均可被双链RNA干扰而沉默,但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后,飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。 相似文献
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CYP86MF反义基因转化获得青花菜雄性不育植株 总被引：6，自引：0，他引：6
通过根癌农杆菌LBA4404（含质粒反义CYP86MF基因片段）介导转化青花菜（Brassica oleracea L.var. italica Plenck）下胚轴，经卡那霉素选择压下连续选择、扩繁和生根培养，获得了青花菜转基因植株。经PCR、Southern blot、Northern blot检测证明，CYP86MF基因已经整合至转基因植株染色体中。经花器官观察，转基因植株中有雄蕊发育不良、花粉不萌发的植株。转基因植株自交不能结实，用转基因植株花粉对正常植株进行人工授粉，不能正常结实，表明转基因植株花粉是不育的。用正常花粉对转基因不育植株进行人工授粉，转基因不育植株能正常结实，表明转基因不育植株的雌性器官发育正常，其不育性与CYP86MF基因在转基因植株中的表达有关。 相似文献
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【目的】明确美国白蛾（Hyphantria cunea）响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGA X软件对5个P450基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰（RNAi）技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2(GenBank登录号：ON032363—ON032367)。系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明,P450... 相似文献
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水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。 相似文献
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《浙江农业学报》2015,(11)
对烟草萜类化合物合成相关的关键基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Ntggpps2(Nicotiana tabacum geranylgeranyl diphosphate synthase gene,Ntggpps)进行克隆,并构建了过表达载体p CAMBIA1302-NT2,通过农杆菌介导的遗传转化,成功获得Ntggpps2过表达的烟草转基因植株。qRT-PCR分析发现,在转基因植株的烟草叶片中,Ntggpps2基因的表达水平是野生型的2.2倍,实现了Ntggpps2在烟草中的高表达,为后续研究烟草Ntggpps基因的生物学功能及其萜类物质合成途径的分子机理提供了研究材料与基础。 相似文献
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水稻Rho GDP解离抑制基因OsRhoGDI2是从幼穗中分离出的功能未知基因。为鉴定该基因的功能,笔者所在实验室前期构建了植物过表达载体pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP,并对水稻进行了遗传转化。对OsRhoGDI2过表达转基因水稻T_2代进行筛选和鉴定,采用PCR技术鉴定转基因植株,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRhoGDI2在转基因水稻中的表达水平,结果显示,其中6个株系为过表达转基因植株,OsRhoGDI2表达水平上调1.69～13.35倍。为检测外源基因在转基因水稻中的拷贝数,分别以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG为内参基因和标记基因,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术结合内参基因和标记基因的标准曲线进行分析,结果显示在所检测的6个转基因株系中,外源基因的拷贝数均为1,提示已经获得稳定遗传的OsRhoGDI2过表达转基因水稻,为后续OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基础。 相似文献
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【目的】研究高效利用氮素基因铵态氮转运蛋白基因JrAMT2,对核桃Juglans regia的品种改良、快速生长及产量形成有重要意义。【方法】以核桃JrAMT2过表达幼苗为实验材料,对JrAMT2基因进行生物信息学分析。通过基因表达量和表型测定对核桃JrAMT2过表达植株生长发育、氮素吸收、叶绿素质量分数、叶绿素荧光进行理化分析。【结果】JrAMT2基因在核桃JrAMT2过表达植株中稳定表达。与野生型相比,核桃JrAMT2过表达株系的株高、节间长、生物量等生长参数显著提高(P<0.05),核桃幼苗的株高、节间长增加,最高可增加68.2%和50.3%,植株地上部分、地下部分生物量显著增加,地上部分最高可增加56.26%(鲜质量)和56.26%(干质量),地下部分最高可增加344.38%(鲜质量)和354.33%(干质量);核桃JrAMT2过表达株系地下部分对铵态氮及硝态氮的吸收显著提高(P<0.05),最高可提高114.1%和70.3%,其中JrAMT2基因介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输,地上部分铵态氮质量分数显著增加(P<0.05),最高可增加59.1%;核桃... 相似文献
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【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象（BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸）;NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因（BnGS2-1或BnGS2-2）均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。 相似文献
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【目的】利用反向遗传学研究拟南芥TUA2与ABA途径相关基因的相互关系以及对种子萌发的影响。【方法】采用PCR、Tail PCR和RT-PCR技术对来自ABRC的T-DNA插入TUA2突变体进行插入位点的鉴定和转录活性的分析;利用转基因技术获得TUA2超表达植株;检测了含不同浓度ABA的MS培养基中各突变体和TUA2超表达植株的种子萌发;通过RT-PCR检测了突变体中ABA途径相关基因HAB、ABI1、RD22和P5CS的表达变化。【结果】突变体tua2-1和tua2-2的T-DNA插入位点均位于TUA2的启动子区,且二者的TUA2表达量均升高。在含有ABA（0.8 μmol•L-1）的MS培养基中,突变体和转基因等5个株系的种子萌发延迟,播种第5天萌发率在6%-18%,相同条件下的野生型种子萌发率为76%;ABI1和HAB在TUA2超表达体中的表达明显低于野生型,受ABA诱导后被诱导表达的程度也远低于野生型。【结论】TUA2可能参与了ABA信号途径对种子萌发过程的调节。 相似文献
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【目的】在盐胁迫条件下,通过对转TaNHX2(小麦Na+/H+转运蛋白编码基因)大豆的盐害表型、光合作用强度以及产量相关农艺性状的考察,评估其生产应用潜力,以期获得具有一定应用价值的耐盐大豆新种质。【方法】以实验室前期获得并初步鉴定具有一定耐盐性的转TaNHX2大豆T4代株系为材料,在主茎第二片复叶完全展开时（V3期）进行草丁膦抗性、PCR和RT-PCR检测。选取阳性植株,在主茎第三片复叶完全展开时（V4期）进行NaCl胁迫处理,处理期间观察记录盐害表型;待植株长至初荚期（R3期）测定其光合作用参数;最后,分单株收获已生长至完熟期（R8期）的大豆植株,考察其株高、节数、单株荚数、单株粒数和单株粒重。其中,昌平春播试验点设置0、150和200 mmol·L-1 3个NaCl浓度,北圃场夏播试验点设置0和200 mmol·L-1 2个NaCl浓度,盐害表型观察以及光合作用参数测定只在北圃场试验点进行。【结果】分子鉴定表明外源TaNHX2在转基因后代中成功转录表达,遗传稳定。在无盐胁迫条件下,转基因与受体植株长势相当,叶片大小相似,光合作用强度相近。而在200 mmol·L-1 NaCl溶液胁迫处理下,转基因与受体植株均出现矮化、叶片变小、光合作用强度降低的现象,但与受体植株相比,转基因大豆株系C12、C21和C19的矮化程度较低,叶片较大,光合作用相关参数数值较大,其中株系C12和C21与受体的净光合速率（Pn）差异具有显著性。另外,无盐胁迫条件下,转基因株系与受体品种自贡冬豆各产量相关农艺性状数值相近,而在昌平试验点设置的150和200 mmol·L-1 NaCl溶液胁迫下,转基因株系各农艺性状数值均高于受体对照,其中150 mmol·L-1 NaCl胁迫下,C12、C21和C19的单株粒重,C19的单株荚数与受体差异显著。200 mmol·L-1 NaCl胁迫处理时,株系C12、C21和C19的单株荚数、单株粒数和单株粒重,C12和C19的株高均与受体对照品种存在显著性差异。在北圃场试验点设置的200 mmol·L-1 NaCl胁迫处理下,转基因株系C12、C21和C19的株高、C19的单株粒数和单株粒重与受体对照品种具有显著性差异。【结论】在盐胁迫条件下,与受体对照品种相比,转TaNHX2大豆株系C12、C21和C19盐害程度较低,能维持较强的光合作用和一定的产量,其中株系C19在2个试验点的产量表现均较佳,具有较大的育种应用价值。 相似文献
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[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。 相似文献
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[目的]探索过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响.[方法]以番茄野生型M82、过量表达miR319和过量表达LA番茄为材料,分析过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响.[结果]过量表达miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、VC和番茄红素的含量下降,而过量表达LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄红素的含量上升,VC含量下降.2个转基因植株可溶性蛋白的含量与M82比较都有所上升.[结论]过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响是相反的,过量表达LA可以提高番茄果实品质. 相似文献
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CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传及表达特性,在获得共转CYP71AV1和CPR基因青蒿(GYR)T0代的基础上,对其T2代用普通PCR和Southern Blot分别检测了目标基因分离比及部分植株中目标基因拷贝数;利用实时定量PCR分析了部分植株中目标基因的转录水平;利用HPLC-ELSD测定了其青蒿素含量;对其关键农艺性状也进行了测定。结果表明虽然目标基因在世代间可以顺利遗传,但其拷贝数则有一些不规则的变化,转基因位点的纯合较难实现;目标基因的表达也受到基因组的修饰限制系统影响。T2代青蒿素含量最高的一组平均含量比对照提高46.9%,植株鲜重和叶片干重则没有显著差异。本研究为进一步获得遗传稳定的转基因青蒿株系打下了基础。 相似文献
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本课题组前期研究获得玉米GRMZM2G455909基因,该研究拟对GRMZM2G455909基因开展生物信息学分析,明确其分子特征;构建过表达载体pCAMBIA1301a-GRMZM2G455909,通过农杆菌介导法获得转GRMZM2G455909基因拟南芥植株,分析转GRMZM2G455909基因拟南芥植株抗病能力及其抗病信号通路。研究表明,GRMZM2G455909基因所编码的蛋白序列属于NBS-LRR类蛋白家族;Pst DC3000处理转GRMZM2G455909基因拟南芥植株,发现转基因植株体内菌体数量明显下降,其抗病性显著增强,推测Pst DC3000可能诱导转GRMZM2G45590基因拟南芥体内形成水杨酸抗病信号通路。研究结果可为作物遗传育种抗病性的改良提供新的路径。 相似文献
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【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene,eglS）,探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。 相似文献
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抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物体内活性氧清除的关键酶,在植物逆境应答中发挥着重要作用。通过构建水稻OsAPX1基因的过表达植物载体,利用根癌农杆菌介导法导入水稻品种日本晴获得转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中OsAPX1表达水平明显提高。田间T0代过表达转基因植株在高温条件下的秕谷率显著低于野生型。热激胁迫实验显示,转基因株系比野生型具有更强的耐热性。在过氧化氢胁迫下,转基因植株也表现出更强的抗氧化能力。该结果表明水稻OsAPX1基因在活性氧清除中发挥功能,过量表达OsAPX1能够增强水稻的高温抗性。 相似文献