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1.
[目的]分离一株近期流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒并解析其基因变异情况.[方法]适当处理猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性临床样品,接种非洲绿猴胚胎肾细胞进行病毒分离,间接免疫荧光试验对所分离病毒进行鉴定;同时用RT-PCR技术扩增其全基因组,并进行序列测定与分析.[结果]分离培养物可引起非洲绿猴胚胎肾细胞出现稳定的细胞病变,间接免疫荧光试验显示有许多特异性荧光,分离培养物中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒.病毒全基因组大小15 323个核苷酸,在非结构蛋白2基因有30个氨基酸缺失的典型标记;其与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株JXA1株、HUN4株和SD-CXA/2008株之间的核苷酸同源性较高,达到98.9％以上;该毒株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SD-CXA/2008株在同一分支上.[结论]分离出一株典型的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株. 相似文献
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从北京地区传染性支气管炎病毒（IBV）肾病变分离株BJ#-1、BJ#-2、BJ#-3株中利用RT-PCR成功扩增出1054bp纤突蛋白S#-1基因高变区。将3段S#-1基因分别克隆到Puc19质粒中,对3个重组阳性质粒进行双向测序,获得3个分离株S#-1基因高变区的序列。将得到的序列与标准株M#-（41）、Beaudette株和疫苗株H#-（120）及广东地方分离株D#-（41）株进行核苷酸和氨基酸同源性比较分析,并进一步推导它们的蛋白二级结构进行比较。结果表明,3株分离株与M#-（41）株的核酸碱基序列和氨基酸序列同源性比与H#-（120）株和Beaudette株的高,而蛋白二级结构却与H#-（120）疫苗株最为相近,暗示核酸碱基序列差异与病毒抗原决定簇的二级结构变化进而导致血清型变化三者之间的复杂关系。 相似文献
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我国鸭肝炎病毒分离株基因组的测定与分析 总被引：2，自引：0，他引：2
对我国鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)分离株YZ和CL的全基因组进行了序列测定分析.结果表明,2分离株的基因组全长分别为7 713 nt和7 709 nt,包括626 nt的5′UTR、6 747 nt的ORF、314 nt的3′UTR以及23 nt和19 nt的poly(A)尾.结构蛋白VP0含有保守的四肽CPRP,VP3的N端存在一段约20个氨基酸的碱性氨基酸富集区域;VP1缺少RGD(Arg-Gly-Asp)基序.DHV2分离株存在3个不相关的2A蛋白基序,其中2A1蛋白类似口蹄疫病毒属的2A蛋白,2A2蛋白与AIG1蛋白(拟南芥)和GTPase更为相似,2A3蛋白则与副肠孤病毒属的2A2蛋白类型相似;2C蛋白含有保守基序EPxxxxxxGxxGxGK(S/T)、QxxxxxDDxxQ和KGxxxxSxxxxxS/T.3C蛋白含有催化三联体H38-D69-C144;3D蛋白包含KDELR、DxxxxD、GxxSGxxxTxxxNx、YGDD和FLKR等RNA聚合酶的特征基序.基于多聚蛋白、VP1、2C和3C蛋白的进化关系分析结果均表明,DHV分离株与副肠孤病毒属的遗传关系最近,但占据一个清晰的独立遗传谱系,应将DHV单独划属. 相似文献
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为制备高纯度、均一的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒,将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因序列(C-E3-E2-6K-E1)人工合成后克隆至杆状病毒-昆虫细胞表达载体中;重组质粒转化DH1OBac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆状病毒杆粒;重组杆状病毒杆粒转染ExpiSf9昆虫细胞,包装获得重组杆状病毒,并再次感染ExpiSf9昆虫细胞表达基孔肯雅结构蛋白;通过细胞超薄切片验证杆状病毒的产生,并用流式细胞仪测定病毒滴度;免疫荧光、蛋白免疫印迹分析目的蛋白的表达,透射电镜鉴定病毒样颗粒的形成;最后,通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒样颗粒.结果表明:成功构建了含基孔肯雅病毒结构蛋白的重组杆状病毒杆粒,获得了高滴度的重组杆状病毒,重组杆状病毒表达了基孔肯雅病毒的结构蛋白,结构蛋白自组装成60～70 nm的颗粒.这一研究通过昆虫杆状病毒表达系统成功制备了纯度高和均一性好的基孔肯雅病毒样颗粒,为基孔肯雅病毒的诊断试剂和疫苗研发奠定了基础. 相似文献
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为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。 相似文献
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猪繁殖—呼吸综合征病毒上海分离株的病毒特性研究 总被引：3，自引：0，他引：3
对猪繁殖－呼吸综合征病毒（PRRSV）上海分离株（SH1）的理化特性和结构蛋白进行研究。结果表明，SH1分离株能致Marc-145细胞典型病变，TCID50为10^5.0mL^-1。对氯仿和乙醚、酸（pH5．5以下）、碱（pH8以上）、热（水浴56℃10min以上、37℃24h以上、28℃48h以上）均敏感。病毒负染可见以具囊膜的球形为主，囊膜上有纤突，大小为60－85nm。超薄切片可见病毒存在于细胞浆中。SH1分离株的病毒培养液经差速离心和非线性蔗糖密度梯度纯化，SDS－PAGE显示病毒结构蛋白的相对分子质量24000，19500，16000。免疫转印可见3条结构蛋白均能被PRRSV美洲株高免血清识别。 相似文献
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[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变. 相似文献
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4株高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离与鉴定 总被引：8，自引：3，他引：5
2007年7月从江苏某些猪场采集的具有明显高热症状的病料组织中分离出4株病毒,经对病毒的TCID50测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确认这4株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒.病毒基因序列分析发现:4株病毒的NSP2基因均存在2处共30个氨基酸缺失,缺失氨基酸分别位于481位、532～560位.氨基酸序列同源性分析可见:分离株与VR2332株、MLV株的同源性很低,在60.3%至68.6%之间;与国内疫苗株CH-1a的同源性为83.1%～83.7%;与国内分离的变异株JXAI株、HUN4株、HB-1(sh)/2002株同源性很高,为91.2%～98.5%;同时4株分离株之间的同源性很高,为99.3%～100.0%.系统发育树表明:分离的4个毒株与JXAI毒株和HUN4株有较近的亲缘关系,与其他株的亲缘关系较远.动物回归试验表明,4株病毒均可以引起仔猪明显的临床高热症状. 相似文献
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The genome of the isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） from China, designated HPBEDV, was sequenced and analyzed. The size of the genome of HPBEDV was 15 334 nucleotides （nt）. Comparative analysis of HPBEDV with the genomic sequences of the domestic and other isolates （JXA 1, HUN4, CH-1 a, B J-4, VR2332, and LV） revealed that HPBEDV shared 98.4, 98.0, 89.0, 88.7, and 88.6% identity with the American strain JXA1, HUN4, CH- 1a, BJ-4, and VR2332, respectively, but only 54.7% identity with the European reference strain Lelystad virus. The NSP2 gene had 2 850 nt and encoded 950 amino acids （aa）, with two discontiguous deletions of 1 aa and 29 aa at positions 482 and 534-562, respectively, relative to VR-2332. Also, phylogenetic analysis with the published PRRSV genomic sequences indicated that the newly emerging isolate form a clade with the VR-2332 isolates. Therefore, HPBEDV was a novel strain with deletions in NSP2 gene. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征河南毒株Henan-1的分离及其NSP2、ORF3、ORF5的序列分析 总被引：3，自引：3，他引：0
将2007年1月河南省某猪场送检的疑似高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,出现细胞聚集、固缩、脱落等特异性细胞病变.根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因序列设计并合成针对NSP2、ORF3和ORF5基因的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆入pMD18-T载体进行测序.并与国内外已发表的毒株的序列进行比较.结果表明:分离毒株Henan-1是美洲型PRRSV,而且NSP2基因发生30个AA的不连续缺失;Henan-1的NSP2、ORF3和ORF5基因与JXA1、JX0612、HZ-X、HB-1(sh)、CH-la、HB-2(sh)、SP、ATCC VR-2332、Henan-HN1、Resp PRRS/Repro MLV、PA8、BJ-4等毒株等位基因的核苷酸同源性分别为83.0%～99.0%、88.3%～99.2%、88.6%～99.5%,推导的氨基酸同源性分别为66.7%～97.9%、84.7%～98.8%、87.1%～99.5%;而ORF3和ORF5基因与LV4.2.1等位基因核苷酸同源性分别为64.7%和64.2%,推导的氨基酸同源性分别为56.7%和61.0%.基因系统发育树分析表明:Henan-1与JXA1、JX0612株的亲缘关系很近,与HB-1(sh)亲缘关系较近,与HZ-X、CH-1a、HB-2(sh)、SP、RespPRRS/Repro MLV等毒株处于不同的分支. 相似文献
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[目的]掌握新疆南疆PRRSV流行毒株特点,为新疆南疆PRRS的有效预防和控制提供理论依据.[方法]研究利用克隆和测序获得了8个新疆南疆PRRSV ORF5基因全序列,并进行序列分析.[结果]8个新疆南疆PRRSV ORF5基因长度均为603 bp,它们之间核苷酸同源性为87.4; ～ 100.0;;与欧洲型代表株LV、美洲型代表株ATCC VR-2332、中国代表株CH-1a和中国HP-PRRS代表株JXA1核苷酸同源性分别为60.9;～63.5;、88.4;～ 89.9;、88.9; ～ 94.7;和87.4;～98.7;;与中国猪养殖场常用的几种弱毒疫苗株核苷酸同源性为87.4;～94.7;;与美洲型毒株和欧洲型毒株氨基酸同源性为84.5;～98.0;和50.0;～59.5;.[结论]研究的8株新疆南疆PRRSV株均属于美洲型亚群Ⅱ毒株.利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结论,可为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择等做迸一步的调整或指导奠定基础. 相似文献
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广西PRRSV、PCV、CSF的混合感染及PRRSV分子病原学研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况,从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及猪瘟病毒(CSF)检测,并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示,经PCR检测,86份样品中有60份为PRRSV阳性,36份为PCV阳性,2份为CSF阳性,说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSVORF5基因序列比较分析发现,来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源,核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,推导编码的氨基酸序列同源性为98.0%~100.0%;与VR2332和LV株的核苷酸序列同源性分别为88.7%~89.7%和62.2%~63.1%,氨基酸序列同源性分别为88.6%~89.6%和60.5%~61.3%,表明7个县市不同毒株的ORF5基因区域变异不大,均属美洲型。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析 总被引：6，自引：0，他引：6
以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株为材料，采用RT－PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长603bp，可编码200个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR－2332株在氨基酸水平上的同尖性分别为58％和90％，与国内首株分离株(CH－1a)的同源性高达95％，推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列，与具有代表性的12株美洲型毒株和2株欧洲型毒株绘制进化系统树，结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近，而与欧洲毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析，发现YA株ORF5编码的E蛋白存在5个潜在的N－糖基化位点，6个抗原位点，其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲毒株均存在一定程度的差异，但3个最主要的抗原表位相对保守。 相似文献
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公猪精液PRRSV变异株检测及NSP2、ORF5基因序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用荧光RT-PCR方法从某猪场精液中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异株(NSP2 1 594～1 680 bp缺失)核酸阳性.提取1份阳性样品病毒核酸测定和分析其NSP2和OBF5全基因序列,结果表明NSP2基因由950个氨基酸组成,与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比481位缺失1个氨基酸、532～560位连续缺失29个氨基酸,与JXA1、HUN4等毒株具有相同的缺失特性;ORF5基因第13、151位为具有强毒特性的精氨酸(R),存在4个潜在的糖基化位点,分别位于30～32、35～37、44～46和51～53位氨基酸.遗传进化分析表明,测定序列与JX-A1、HUN4等毒株关系最近,与CH-1a、NVSL等同属一个大分支,而与BJ-4、P129、RespPRRS MLV、VR-2332等处于不同分支.研究证实公猪精液可携带PRRSV变异株,因此猪场(群)在人工授精和引进精液时必须强化检疫和生物安全措施. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用 总被引：4，自引：1，他引：3
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物.分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PER条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PER诊断方法.应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株.试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PER诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据. 相似文献
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豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。 相似文献
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为了了解云南猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的遗传变异情况及其与猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学关系,对2010年分离到的10个云南PRRSV流行毒株进行了ORF5基因序列的测定与分析。结果显示云南分离株与中国大陆首次分离株CH1a,北美代表株VR2332和欧洲型代表株LV之间的核苷酸同源性分别为93.2%-94.2%,87.4%-89.6%和62.5%-64.0%;氨基酸同源性为90.0-91.5%,87.1-88.6%和51.7-57.7%。遗传进化分析显示,云南10株分离株属于美洲型,并分为两个基因亚型。与传统毒株相比,云南分离株ORF5基因及其推导的氨基酸的变异主要以点突变为主,但关键氨基酸位点未见明显改变,表明目前云南省所流行的PRRSV仍以经典毒株为主。研究结果为云南猪繁殖与呼吸综合征的控制提供了依据。 相似文献