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从２型犬腺病毒的ＭＤＣＫ细胞培养物中提取线状双链病毒基因组ＤＮＡ，利用限制性内切酶ＰｓｔＩ、ＢｇｌⅠ和ＨｉｎｄⅢ分别进行酶切，在１％琼脂糖凝胶上电泳，随后Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹到尼龙膜上，利用Ｄｉｇｏｘｉｎ标记的２型犬腺病毒Ｅ３区ＰＣＲ产物与膜上ＤＮＡ杂交，结果发现，Ｅ３区探针分别与病毒ＤＮＡ的ＰｓｔＩＢ片段、ＢｇｌＩＡｌ片段和ＨｉｎｄⅢＡ２、Ｂ２片段呈现阳性杂交反应，该结果为Ｅ３区的克隆及犬腺病毒 相似文献
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首先应用血凝抑制试验(HI)和对流免疫电泳交叉试验,对从我国分离的貂肠炎病毒(MEV)、豹细小病毒(LPV)、犬细小病毒(CPV)和貉细小病毒(RPV)进行了血清学比较研究,发现这4种病毒在血清学上关系密切.然后从感染病毒48h的猫肾传代细胞中分别提取、纯化这4种病毒的中间复制型DNA(RF-DNA),以λ—DNA—Hind Ⅲ片段为分子量标记,确定4种病毒的RF—DNA分子大小均在5kb左右.再应用限制性内切酶Hac Ⅲ和Hind Ⅲ分别完全酶切4种病毒的RF—DNA.结果表明,应用Hind Ⅲ酶切,4种细小病毒的RF—DNA都产生3个酶解片段;应用Hac Ⅲ酶切,MEV产生3个酶解片段,其余3种病毒产生4个相同的酶解片段,从而可将MEV与其余3种病毒明显地区别开.Hac Ⅲ酶切MEV和CPV的结果与国外报道的“MEV产生5个片段,CPV产生6个片段”不同. 相似文献
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鹑源减蛋综合征病毒QAVc—94株的酶切图谱分析 总被引：2，自引：0，他引：2
选HindⅢ、EcoRⅠ、PstⅠ、SphⅠ、BamHⅠ、BamHⅠ和BglⅠ6种限制酶，对QAVc-94株和AV－127国际标准株的DNA进行酶切图谱比较结果发现，QAVc-94株用上述6种酶酶切得到的片段数分别为10、3、12、4、6、9条，将各片段碱基数相加得出其基因组长34.7kb，略高于国内的报道，而与Zask等的结果相接近，从分子水平上将QAVc-94鉴定为一株EDSV。对照AV－127株的酶切结果与文献报道相符。QAVc-94株酶切图谱分析显示：HindⅢ和EcoRⅠ的酶谱与报道的其他EDSV分离株基本相似，HindⅢ的酶谱与国内研究最多的AA－2长春分离株一致，EcoRⅠ的酶谱结果与Zask等报道的B8／78株相同。而其他4种限制酶的酶切图谱与已报道的各地分离株相比，差异较大，如PstⅠ和BglⅠ多出2－5个识别位点。说明鹌鹑源EDSV已与鸡源、鸭源、鹅源EDSV有较大的变异，是一株血清型相同而基因型不同的鹌鹑减蛋综合征病毒。 相似文献
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将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达. 相似文献
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PCR检测犬腺病毒方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用人工合成的两条引物,对病犬肝脏和细胞培养物冻融上清中的1、2型犬腺病毒DNA进行多聚酶链式反应（PCR）检测;再将扩增产物进行同位素标记,与纯化病毒DNA进行打点杂交。扩增产物经电泳分析结果表明,其大小与设计的引物间的序列大小基本一致;扩增产物经标记后只与犬腺病毒DNA发生杂交反应,表明其为犬腺病毒特异性核酸片段。 相似文献
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山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对山羊痘病毒贵州分离株（LD株和QL株）和参考株（Y株和B株）,采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48h～60h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1．8～1．9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。 相似文献
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貂肠炎细小病毒复制中间型 DNA(MEV-RF-DNA)的 HindⅢ-C 片段被克隆到 pBR322中形成重组质粒pBM。用光生物素(photo biotin)标记 pBM 和 HindⅣ酶切片段的 pBM 作为探针分别与貂,太细小病毒感染的细胞培养物人工感染细小病毒的貂和犬粪便进行斑点杂交试验,结果发现两种探针检测的敏感性相差10倍以上.光生物素标记的完整重组质粒探针具有放大作用,酶切后的 pBM 敏感性不如前者.另外,本实验还证明在用生物素标记的探针杂交时,被检样品用热变性处理比碱变性处理效果更佳,而且简便。 相似文献
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分离自不同种、不同部位的6种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)毒株经限制罂内切酶 EcoRⅠ、HindⅢ、RstⅠ和 SmalⅠ消化分析后呈现3种酶切电泳图.2株分离自精液的病毒(美精株和洛精株)4种酶切电泳图完全相同;Bartha Nu/67株与美精株和洛精株仅在 EcoRⅠ酶切图谱上有微小差异(一个酶切位点的变化),其它3种酶切图也完全相同。分离自水牛的 B7株与其它5种病毒DNA 的酶切图谱差异十分显著。2株分离自呼吸道的病毒(IBR-125和 LA 侏)与其它几株病毒差异也较明显,但二者之间也有一定的差异。 相似文献
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利用高渗缓冲液裂解感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,加入核酸酶消化细胞DNA,再抽提病毒DNA的方法提取鸭瘟病毒基因组,结果证明,这种方法可以最大限度地消除细胞DNA的污染,得到纯净的病毒基因组DNA.用10种限制性内切酶对鸭瘟病毒疫苗株和分离株的基因组进行酶切分析,酶切产物电泳结果表明,Sma Ⅰ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ 7种限制酶产生酶切图谱二者几乎完全一致,EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ仅有个别条带不同,BglⅡ产生的条带迁移率差别较大,但条带数量相同. 相似文献
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试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。 相似文献
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用SDS-ProteinaseK消化EDSV抗原-抗体复合物,苯酚-氯仿抽提DNA,得到了完整的EDSV基因组DNA,用限制性内切酶BalⅠ、BalⅡ、BamHⅠ、ClaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、SmalⅠ、XbaⅠ酶切及EcoRⅠ BamHⅠ双酶切消化,对EDSV分离株Hd1的DNA进行了限制性内切酶酶切分析。结果表明,分离株Hd1与标准株AV127DNA各酶切片段数及各片段的相对分子量(kb)未见差异,说明分离株Hd1和标准株AV127属于同一基因型。将EcoRⅠ BamHⅠ双酶切得到的7个片段,与双酶切线性化的pUC19载体质粒连接,转化E.coliDH5α,克隆了其中的5个片段。 相似文献
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鸡产蛋下降综合征(EDS-76)病毒DNA探针制备 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡产蛋下降综合征（EDS－76）病毒由鸭胚培养增殖，60％饱和度的（NH4）2SO4沉淀，经差速离心和蔗糖垫超速离心提纯病毒。蛋白酶K和SDS消化后，苯酚抽提、乙醇沉淀分离EDS－76病毒DNA。用HindⅢ、BamHI、PstI、EcoRI进行病毒DNA酶切图谱分析。EDS－76病毒DNA经PstI限制酸酶切与pUC19质粒载体连接，转化了JPA101大肠杆菌细胞，筛选带有插入片段的白色菌落，并将筛选的克隆进杆快速酶切鉴定;用光敏生物素标记制成探针。结果表明：所选克隆只与EDS-76病毒DNA杂交，克隆片段的为3kb，标记探针能检出10pg的EDS－76病毒DNA。 相似文献
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本校军事兽医研究所病毒研究室赵永军等通过酶切,由貂肠炎细小病毒(MEV)的复制型DNA(RF-DNA)获得HindⅢ C,将其克隆至pBR322中,构成重组质粒pBM,经转化大肠杆菌RRI扩增后,提纯pBM,再作HindⅢ酶切,用低融点琼脂糖凝胶电泳回收C片段。用随机引物法以α—~(32)P—dATP标记C片段和pBM,采用打点杂交技术,以这两种探针检测了6种动物的细小病毒细胞培养物和其它科5种病毒,同时检测了貂和犬的粪便标本33份。 相似文献
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《贵州畜牧兽医》2015,(6)
利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献