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应用实时荧光定量PCR法检测仔猪肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌 总被引：1，自引：1，他引：0
《山西农业科学》2019,(8):1477-1480
应用实时荧光定量PCR法对1月龄仔猪粪便中所含的乳酸杆菌和双歧杆菌进行定量检测,揭示肠道相关菌群改变在仔猪腹泻发病中的作用及意义,研究分别设计乳酸杆菌和双歧杆菌的特异性引物和探针,收集仔猪出现腹泻症状的粪便样本30份及正常对照样本30份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR检测细菌的数量。结果表明,仔猪出现腹泻症状的粪便组乳酸杆菌和双歧杆菌的数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义。表明肠道菌群与腹泻的发生有一定的关系。 相似文献
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实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用 总被引：16，自引：3，他引：13
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR的原理、影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。 相似文献
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[目的]建立瓜蔓枯病菌(Didy mella bryoniae)的实时荧光PCR方法,为瓜蔓枯病菌快速分子检测奠定基础.[方法]通过Genebank网上已公布序列,选取瓜蔓枯病菌beta-tubulin(tub2)基因作为目的基因,设计了特异性引物和Taq Man探针,并对该引物和探针的反应条件进行优化.[结果]采用研究所设计的引物和探针对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,该引物和探针可高度灵敏地检测到瓜蔓枯病菌.采用实时荧光PCR方法,25μL体系中只要有8.9 pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到356 fg/μL,比普通PCR灵敏度高10倍.[结论]采用研究所设计的引物和探针对田间采集的病株和未知样品的检测,验证了引物和Taq Man探针的特异性. 相似文献
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梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用 总被引：1，自引：1，他引：0
本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。 相似文献
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为了建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法,本试验参考GenBank已发表的副猪嗜血杆菌(Hemophilus parasuis,HPS)转录起始因子infB基因序列,利用生物学软件Primer Express 2.0设计特异性引物和探针;并对副猪嗜血杆菌标准菌株提取DNA后进行PCR扩增,将产物测序鉴定后克隆到pMD1s-T载体,再转化到大肠杆菌感受态细胞,细菌培养后对菌液进行PCR扩增,把产物测序鉴定后获得的重组质粒作为标准阳性对照;最后将建立的TaqMan探针荧光PCR方法进行灵敏度、特异性、稳定性试验.结果显示,该检测方法可以达到1μl1.0×101拷贝数量级的灵敏度;另外,该方法可以将HPS和大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开,特异性良好;稳定性试验显示,2次批内变异系数分别为0.65％和0.92％,批间变异系数为1.31％,稳定性良好.对口岸送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测,结果表明TaqMan探针荧光PCR方法和细菌分离方法的检测效果一致. 相似文献
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荧光定量PCR技术研究进展及其应用 总被引：3，自引：0，他引：3
荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,更以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为分子生物学研究的重要工具,并用于生物特异核苷酸的检测.主要概述了荧光染料法、TaqMan探针法、分子信标法、Lux Primer 4种荧光定量技术的原理、特点以及荧光定量PCR技术在各方面的应用. 相似文献
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【目的】建立含有扩增内标（IAC,Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin 基因和鸡的transforming growth factor 基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。 相似文献
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【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。 相似文献
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以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT),并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性。结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L~(-1)及探针浓度为10μmol·L~(-1)时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567,R~2=0.961 1),该方法的灵敏度为10~3个·mL~(-1)孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100%,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。 相似文献
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《新疆农业科学》2017,(1)
【目的】建立一种快速、准确的鼠李糖乳杆菌检测方法。【方法】根据已报道的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的gyr B基因保守序列,设计用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性DPO引物,结合SYBR Green I实时荧光PCR技术,建立鼠李糖乳杆菌的实时荧光PCR检测方法,评价其特异性和灵敏度,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。【结果】该方法对2株鼠李糖乳杆菌能得到阳性扩增,而其余10种乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,而且在退火温度为50~60℃不影响其特异性;该实时荧光PCR检测灵敏度比农业部标准中普通PCR检测高10倍;用10种微生物肥料及其它益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。【结论】研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够准确、高效的检测微生物肥料及其他益生菌产品中的鼠李糖乳杆菌。 相似文献
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【目的】在分子水平上探讨伴大豆球蛋白水解肽对肠道双歧杆菌生长的影响。【方法】选取21日龄健康清洁级雄性SD大鼠,随机分为4个处理,每个处理3只,基础日粮预饲一周后,分别灌胃生理盐水（对照组）、伴大豆球蛋白液（Conglycinin组）、伴大豆球蛋白酶水解肽P2组分（P2-PTC组）、伴大豆球蛋白盐酸彻底水解液（HCl-FHC组）,各0.5 ml,1次/天。除对照组外,各处理组灌胃液体总含氮量相等（折合蛋白含量为0.5 mg?ml-1）,实验共21 d。应用PCR-DGGE技术分析灌胃伴大豆球蛋白酶解肽对大鼠粪样细菌区系变化的影响,并采用连续稀释PCR的方法半定量研究伴大豆球蛋白酶解肽对大鼠肠道双歧杆菌数量的影响。【结果】灌胃伴大豆球蛋白酶解肽的大鼠在实验后第1周,其粪样微生物区系变化迅速,而后缓慢,最终形成稳定的体系,提示酶解肽在一定程度上影响了肠道细菌的组成,与对照组和蛋白盐酸彻底水解液组比较,肠道双歧杆菌数量明显增加。【结论】本试验在分子水平证明了伴大豆球蛋白水解肽对肠道双歧杆菌的生长有促进作用。 相似文献
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[目的]建立贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法。[方法]根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比。[结果]所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。[结论]研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。 相似文献
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为了建立从生物制品和人粪便中快速分离鉴定双歧杆菌的方法,利用双歧杆菌16S rRNA特异性扩增引物,通过PCR技术对双歧杆菌制剂和人粪便中分离菌种进行快速鉴定;同时结合革兰氏染色、穿刺实验、糖发酵实验等技术对分离的双歧杆菌的生理生化等特征进行了研究。琼脂糖电泳结果表明,利用特异性扩增引物的扩增产物在1 500 bp处出现特异性条带,革兰氏染色、糖发酵试验等也验证了分离菌种为双歧杆菌。说明利用16S rRNA的PCR方法鉴定双歧杆菌具有快速、灵敏、操作简单等优点,可以直接将双歧杆菌快速鉴定到属。 相似文献
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DUPeng DULi-hui HUOGui-cheng 《东北农业大学学报(英文版)》2005,12(1):48-52
Viability of bifidobacteria in freeze-dried probiotic products at various temperatures during prolonged storage was assessed. Bifidobacterium longum and Bifidobacterium infantis were freeze-dried. The freeze-dried preparations were stored at -18,4, and 20℃ Cell counts were enumerated using BS agar at 37℃ for 48 h under anaerobic conditions at 0, 45 and 120 days. Storage at 20℃ showed the greatest decline in the viability of bifidobacteria, whereas that at -18℃ showed the least decrease. 相似文献
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【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst 基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBR Green I的信号来实现检测。通过对此方法的可行性、单壁碳纳米管最适浓度、目标链最适浓度、特异性等进行验证,建立产TSST-1金黄色葡萄球菌tst 基因的检测体系。【结果】在仅加入终浓度为1.07 nmol/L目标DNA的条件下,荧光值的恢复率达91%,荧光值的增强值为4.764。最适碳纳米管浓度为30 μg/mL,最适目标DNA浓度与探针DNA浓度相等,为1.07 nmol/L。特异性检测结果表明,该检测方法可以区分具有高相似性的序列（2-或12-nt的区别）。【结论】SYBR Green I结合碳纳米管适用于环境、食品及临床检验中对携带tst 基因的金黄色葡萄球菌的快速检测。 相似文献
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【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst 基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBR Green I的信号来实现检测。通过对此方法的可行性、单壁碳纳米管最适浓度、目标链最适浓度、特异性等进行验证,建立产TSST-1金黄色葡萄球菌tst 基因的检测体系。【结果】在仅加入终浓度为1.07 nmol/L目标DNA的条件下,荧光值的恢复率达91%,荧光值的增强值为4.764。最适碳纳米管浓度为30 μg/mL,最适目标DNA浓度与探针DNA浓度相等,为1.07 nmol/L。特异性检测结果表明,该检测方法可以区分具有高相似性的序列（2-或12-nt的区别）。【结论】SYBR Green I结合碳纳米管适用于环境、食品及临床检验中对携带tst 基因的金黄色葡萄球菌的快速检测。 相似文献
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西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。 相似文献
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为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。 相似文献
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牛血清白蛋白与Indo-1相互作用时构象变化的荧光光谱法分析 总被引：1，自引：0，他引：1
系用荧光光谱及吸收光谱法证明了牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与荧光探针Indo-1共存时二者能够发生相互作用,并用同步扫描荧光光谱法研究了BSA与Indo-1相互作用时构象变化的情况,考察了溶液的酸度对二者相互作用的影响.结果表明,荧光探针Indo-1在与BSA相互作用时未引起该蛋白质构象的变化,认为Indo-1可作为荧光探针用于诸如BSA这样的蛋白质与其它配体相互作用的荧光光谱法研究. 相似文献