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1.
金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3(hAT)超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前景.鉴于Tgf2转座酶基因(JN886591)存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET-28a(+),将重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞.该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD600≈0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即菌体中含有8.8％的重组蛋白,上清液中含有4.0％重组蛋白.采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到分子量约70 ku的可溶性重组蛋白,经MALDI-(TOF)/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶.进而采用分子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明:所得重组Tgf2转座酶能识别并结合含Tgf2转座子特异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座.采用原核表达体系高效获得重组Tgf2转座酶,为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础. 相似文献
2.
为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。 相似文献
3.
以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。 相似文献
4.
【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。 相似文献
5.
为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因，使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体，经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序，构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导，纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示，ORFV116基因全长561 bp，编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa，为不稳定亲水性蛋白；无信号肽、保守结构域及跨膜结构域；含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点；二级结构以无规则卷曲为主，分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）；预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示，ORFV116蛋白大小约为51 kDa，主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。 相似文献
6.
为探究 DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到 JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌（DE3）感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为 JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的 DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4 ℃低温胁迫下, JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。 相似文献
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【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因（即T基因）编码区（CDS）,并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB（DE3）大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA（iELISA）法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1 335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。 相似文献
8.
【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSV orfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSV orfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000～1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。 相似文献
9.
为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子 Smad9对鹅卵泡发育的调控作用，研究采用RNAi技术干扰 Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位， Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析，探讨 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示，SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞，Smad9-siRNA显著抑制 Smad9的表达。 Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低，细胞上清中雌二醇（E2）的水平显著下降，孕酮（P4）水平未见明显变化，细胞色素P450芳香化酶基因（ CYP19A1）和促黄体素受体（LHR）基因的表达显著下降，促卵泡素受体（FSHR）基因的表达无显著变化。这些结果表明，干扰 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响，其机制可能是 Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E2合成减少和LHR的表达下降有关。 相似文献
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【目的】探讨原核表达猪囊尾蚴TsCL-1蛋白的生物学特性,为研究半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)在猪囊尾蚴与宿主相互关系中的作用奠定基础。【方法】将含有猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的pGEX-4T TsCL-1重组质粒转入大肠杆菌BL21进行表达,诱导后的重组菌裂解上清通过谷胱甘肽（GST）琼脂糖亲和层析法进行纯化,纯化产物利用明胶蛋白电泳法进行活性检测。【结果】经SDS-PAGE分析显示,猪囊尾蚴TsCL-1基因表达的重组蛋白相对分子质量约为61 ku,表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的57.4%。表达产物应用GST琼脂糖凝胶纯化后,纯化蛋白的纯度可达90%以上。明胶蛋白电泳结果显示,纯化蛋白对明胶具有水解活性,并且其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64抑制。【结论】从重组菌中成功表达了目的蛋白,该蛋白具有明显的水解活性,且E-64对其水解活性有抑制作用。 相似文献
11.
稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。 相似文献
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为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。 相似文献
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为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。 相似文献
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采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。 相似文献
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利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。 相似文献
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采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。 相似文献
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LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础. 相似文献
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必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。 相似文献
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为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H2O2、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H2O2胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。 相似文献
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为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象，本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型，早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花，而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花，并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中，PsoRPM2基因表达高于晚花，同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示，PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上，新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作，提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达，从而加快花芽分化进程，导致植株提前开花。 相似文献