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【目的】针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究,用以优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）的条件。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”：以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”：以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化：按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg）和脂质体2000 的比例为1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组（P＜0.05）,且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组（山羊成纤维细胞正常生长组）。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。 相似文献
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华东葡萄抗白粉病基因差异表达cDNA克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为筛选和克隆华东葡萄抗白粉病相关基因,以高抗葡萄白粉病的华东葡萄株系白河-35-1为材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术进行在白粉病病原菌诱导下抗白粉病差异表达基因的研究,筛选出适宜DDRT-PCR的引物组合184对,获得抗白粉病差异表达的cDNA片段13个,序列分析结果显示其功能分别涉及转录调控、能量代谢、蛋白合成、防御反应等生理生化过程,表明华东葡萄白河-35-1抗白粉病是诸多代谢途径相互协调作用的结果。这些差异片段的获得为探明葡萄抗白粉病分子机制提供了前期理论基础。 相似文献
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为研究环境胁迫条件下热休克蛋白60 mRNA(hsp60 mRNA)转录水平和应激性损伤的关系,将30日龄AA肉鸡的饲养环境温度从(22±1) ℃突然升高到(37± 1) ℃分别热应激1、2、3、5和10 h后剖杀,利用临床血液病理学、组织病理学和荧光定量PCR方法,观察热应激不同时间对肉鸡重要器官心脏和肾脏组织损伤及其hsp60 mRNA表达水平的影响.结果显示,持续热应激处理后的肉鸡血液肌酸激酶(CK)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)均显著升高,CK在2、3、5和10 h与对照组(无热应激)差异极显著(P<0.01),ALT在3 h与对照组差异显著(P<0.05),在5 h和10 h差异极显著(P<0.01);持续热应激处理2 h后的肉鸡心脏和肾脏组织均呈现出不同程度的以颗粒变性和水泡变性为主要特征的病理性损伤;心脏和肾脏组织中hsp60 mRNA转录水平在热应激2 h时显著高于对照组(P<0.05),而在5、10 h逐渐恢复正常.提示:hsp60 mRNA转录水平与其相应蛋白的表达和肉鸡组织的热应激损伤存在一定程度的关联性. 相似文献
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[目的]研究不同精粗比日粮对育成黑藏羊小肠中小肽转运载体1(PEPT1)、钠-葡萄糖转运蛋白1(SGLT1)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)以及酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)基因mRNA表达丰度的影响.[方法]选择体重相近(10.45±0.96)kg且健康的2月龄断奶黑藏羊公羔60只,随机分3个处理组,每组20只,分别饲... 相似文献
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纤维化肝窦内皮细胞中基因表达的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
按照肝脏受TAA损伤的程度把试验动物Wisatr大白鼠分为两组（TAA－1和TAA－2），Northern杂交分析表明，在TAA－1的窦内皮细胞中，bcl-x和bax基因的表达水平轻微降低，随着肝损伤的增加，表达水平再度下降。核Run-off转录分析表明，两组的窦内皮细胞、总的RNA合成率下降约30％（P＜0．001）；TAA－1、bad、bax和cyclinE的mRNA合成有所降低，而cyclinA的mRNA合成则明显增加；TAA－2、bad、bax和bcl-2的mRNA合成增加了2－3倍，bcl-x的mRNA合成增加了7培多。 相似文献
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热应激对SH-SY5Y细胞中PrP及HSP90 mRNA转录水平的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
人神经细胞SH-SY 5Y常规法培养至长满细胞瓶(120 cm2)后均分为A~I 9个小细胞瓶(30 cm2),37℃培养15 h后,B~D组在42℃条件下分别进行0.5、1和2 h的持续热应激处理,而E~I组于42℃热应激处理0.5 h后,37℃分别恢复1、3、8、12、24 h。持续热应激阶段,朊蛋白(P rP)和热休克蛋白(HSP)90 mRNA水平显著提高(P<0.01),应激2 h时,P rP和HSP 90 mRNA水平分别约为对照组(A组)的2.5和5倍;在应激后恢复初期(1~3 h),P rP和HSP 90mRNA水平也显著升高(P<0.01),其中恢复到3 h时,P rP和HSP 90 mRNA水平分别为对照组的9和7倍;当恢复到12~24 h时,HSP 90和P rP mRNA的转录水平与对照组差异不显著。结果表明热应激可以提高HSP 90和P rP mRNA的转录水平。应激时P rP mRNA转录水平的提高暗示着P rP在细胞应激中起着一定的生物作用。 相似文献
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用单胚mRNA差异显示技术筛选山羊早期胚胎发育相关基因 总被引：1，自引：0，他引：1
用单胚构建的mRNA差异显示技术,对体外培养的山羊早期2、4、8~16细胞期胚胎的基因表达进行研究,并选择1条在2细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明:该片段与人类肽基精氨酸脱亚胺酶基因具有83%的同源性。该基因通过对组蛋白和细胞骨架蛋白翻译后的修饰作用,对早期胚胎发育过程中基因转录和表达的调控起着重要作用,是羊早期胚胎发育过程中的重要影响因子。 相似文献
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为了研究抗虫转基因欧洲黑杨可能产生的非预期效应,为其生物安全评估提供进一步的数据支持,以蒸馏水为对照,通过叶片浸提法测定了非转基因欧洲黑杨鲜叶片及转基因欧洲黑杨鲜叶片水浸提液对小麦、胡萝卜、白菜、油松等植物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明:非转基因欧洲黑杨和转基因欧洲黑杨的叶片水浸提液化感作用都不是十分强烈,且两者的化感作用具有选择性。浸提液在高质量浓度下对部分供试植物(双子叶植物:胡萝卜、白菜;裸子植物:油松)的种子萌发与对照相比表现出了明显的抑制作用,但对单子叶植物小麦种子的萌发并无明显的抑制作用。在对供试种子根生长和苗高的表现上,当受体植物为小麦和油松时,二者与对照相比均无显著的差异;但当受体植物为胡萝卜和白菜时,二者的水浸提液在高质量浓度下与对照相比表现出了明显的抑制作用。与非转基因欧洲黑杨相比,转基因欧洲黑杨的鲜叶片水浸提液化感能力并未因转入B t基因后而发生明显的改变,其对供试种子的萌发、根生长、幼苗生长等方面的负面影响程度比非转基因欧洲黑杨还要弱。 相似文献
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以新疆黑鳞顶冰花种子为实验对象,根据不同休眠机制选取10余种处理方法进行处理,以此比较其对顶冰花种子萌发的影响。研究结果显示：黑鳞顶冰花种子4℃时32 d左右开始萌发,萌发周期80 d左右,萌发率为72%;室温25℃和酸碱处理不适宜萌发;50℃温水、超声波和200 mg/LGA3处理均无显著性差异（P >0.05）;去除种皮极有效促进其萌发（P =0.002<0.01）,萌发率达到88%;刺破种皮+200 mg/L GA3和500 mg/L GA3+15%H2O2处理也能有效促进萌发（P<0.05）,萌发率分别为84%、82%,前者发芽势最好,明显高于其他处理。 相似文献
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盐分和贮藏对胡杨种子萌发的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
在室温下,研究贮藏时间和盐分对胡杨种子萌发以及恢复萌发的影响.结果表明,室温储存条件下胡杨种子的生活力下降较慢,在前4周胡杨种子的活力一直保持在90%以上,10～20周种子活力丧失.浓度低于0.2 mol/L的NaCl溶液对萌发的影响不大;但从0.3 mol/L起,萌发率随着浓度增高而降低,直至0.5 mol/L时为零.且萌发率与盐浓度呈显著的负相关关系.将未萌发的种子转移至蒸馏水中后,萌发恢复率极低,表明NaCl处理后的种子永久地失去萌发力,盐分对胡杨种子萌发的抑制主要是离子毒害,而不是渗透效应. 相似文献
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箭胡毛杨及其亲本酯酶和过氧化物酶的同工酶分析 总被引：11，自引：1，他引：11
用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对箭胡毛杨及其亲本箭杆杨和胡杨酯酶(EST)同工酶和过氧化物酶(PER)同工酶进行了分析,明确了其酶谱的特征及分布,并采用排序分析的方法,对其亲缘关系进行比较分析.结果表明:箭胡毛杨杂种兼具父本与母本的特征,且与母本箭杆杨亲缘关系较近,与父本胡杨的亲缘关系较远,是国内第1个有胡杨血统的生产性杨树品种. 相似文献
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授粉后施加秋水仙碱处理诱导青杨派异源三倍体 总被引：3，自引：1，他引：3
从中国北方地区拓展杨树品种资源考虑,以哲引3号杨为母本,小青杨和北京杨为父本,对授粉后24～96 h的雌花序施加0.3%～0.5%的秋水仙碱溶液处理,获得了26株青杨杂种三倍体.其中尤以授粉后54～66 h时施加秋水仙碱处理的三倍体诱导效果最好,三倍体得率最高,达66.7%. 与二倍体后代群体相比,青杨杂种三倍体具有一定的生长优势,其中哲引3号杨×北京杨三倍体2年生实生苗的地径和苗高平均值分别超出二倍体20%和5%;最优单株的地径和苗高分别达4.42 cm和2.77 m,超出二倍体平均值144%和43%. 青杨派树种的三倍体诱导实践进一步证明,雌花序授粉后施加秋水仙碱处理是一种高效的三倍体诱导方法. 相似文献
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[目的]研究灰胡杨的发芽周期和种子活力情况.[方法]在常温干燥条件下不同储藏时间对灰胡杨种子发芽率和相关酶的影响,NaCl与PEG6000对灰胡杨种子发芽率的影响;不同储藏时间的灰胡杨种子;用比色法测定种子酶活性,滤纸法测定发芽率.[结果]NaCl、PEG及交互作用对种子发芽率有极显著影响,NaCl作用最大;10;的PEG - 6000处理储藏到第27、37 d灰胡杨种子,能够提高种子发芽率.随储藏时间延长,灰胡杨种子发芽率和含水量下降,含水量从第0d到第37 d含水量范围在6.5; ～4.6;,发芽率在第0d到第37 d从66.7;下降至13.3;.灰胡杨发芽后种子ACP酶活性高峰期出现在储藏第0d,ACP含量在1.85 mol/( min·g),第27 d酶活性下降较明显.第37 d时ACP含量下降为0.54 mol/( min·g).灰胡杨种子脱氢酶活性随储藏时间延长呈下降趋势,TTC活性在20.1 mg/mL,储藏到第37 d时TTC活性下降至4.0mg/mL.灰胡杨种子浸泡液电导率显著上升,电导率值变化范围为:113.75～160.94 us/(cm·g).[结论]通过多元回归分析,灰叶胡杨种子绝对含水量与ACP、TTC活性及种子发芽率呈正相关,与电导率值呈负相关. 相似文献
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3个新引进黑杨无性系间水分利用效率差异性研究 总被引：2，自引：1，他引：1
北美杂交黑杨是一种速生但高耗水的树种,筛选高水分利用效率的黑杨品系有重要的理论和实际意义.本文研究了不同水分处理下,3个不同黑杨无性系DN-2、R-270、NE-19的长期水分利用效率(WUE<,L>)、瞬时水分利用效率(WUE<,i>)、叶片碳同位素组成(δ<'13>C)、光合速率(P<,n>)、气孔行为及其相互关系... 相似文献
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青杨派树种雌蕊柱头可授性及最佳授粉时期 总被引：2，自引：1，他引：1
为提高青杨派树种有性杂交和多倍体诱导效率,以小青杨、小叶杨和哲引3号杨等青杨派树种及杂种为材料,用过氧化物酶试纸溶液测试结合授粉观察的方法对其雌蕊柱头可授性及最佳授粉时期进行了研究。结果表明: 在温室水培条件下,青杨派树种花序可授期持续4～5 d; 花序不同部位雌蕊柱头获得可授性的时间不同,基部雌蕊柱头最早获得可授性,而顶部雌蕊柱头获得可授性最晚; 过氧化物酶试纸溶液在具有可授性的柱头表面呈现蓝色阳性反应,在育种实践中,可以应用过氧化物酶试纸溶液快速、有效地对青杨派树种雌蕊柱头可授性进行检测; 3种青杨派树种雌花序柱头最佳授粉期为花序顶部露出芽鳞84～96 h,以此为参照点,对于适时施加理化处理诱导胚囊染色体加倍选育青杨三倍体等工作具有重要的指导价值。 相似文献
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[目的]研究不同温度处理对杂交狼尾草及其母本美洲狼尾草种子萌发的影响。[方法]以杂交狼尾草(Tift23A×N51)F1及美洲狼尾草不育系(Tift23A)种子为试验材料进行种子发芽试验,记录每天的发芽数,计算发芽势、发芽率和发芽指数,测定可溶性糖含量。[结果]结果表明,杂交狼尾草在25和30℃表现出较高的发芽势、发芽率和发芽指数;母本美洲狼尾草在25、30及35℃均表现较强的发芽状况,以30℃为最佳。母本对高温(40℃)亦有良好的发芽表现,而杂交种在较低温度(15℃)的发芽表现要好于母本。可溶性糖含量随着幼芽增长而增加。[结论]杂交种具有一定的抗寒能力,而母本种子具有较强的抗高温能力。 相似文献