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1.
《河南农业大学学报》2015,(6)
利用分生孢子蘸根法筛选棉花黄萎病菌T-DNA插入转化体库,获得了1个致病力减弱的突变体V546,该突变体在PDA平板上不产生微菌核。利用hi TAIL-PCR技术,获得了突变体V546 T-DNA插入的侧端序列。序列比对分析表明,该突变体T-DNA插入位点在大丽轮枝菌基因VDAG_07282.1的编码区。 相似文献
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为阐明大丽轮枝菌微菌核形成发育的分子机理,利用农杆菌介导的遗传转化方法,建立了包含2 000个转化子的大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突变体库,并在查氏、查氏-根或PDA培养基上培养,观察各转化子的菌落形态。从中筛选出130个菌落特征与野生型菌株V08DF1有明显差异的突变体菌株,其中14个突变体菌株为微菌核发育受阻。对这14个微菌核发育异常的突变体菌株进行T-DNA插入的PCR验证,均能扩增到潮霉素抗性基因,Southern杂交显示其中7个为单拷贝插入,5个为双拷贝插入,2个为三拷贝插入,表明T-DNA已经成功整合到这些突变株的基因组DNA中。 相似文献
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棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析 总被引：7，自引：4，他引：7
【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。 相似文献
4.
为阐明与大丽轮枝菌微菌核发育相关的聚酮合成酶基因VdPKS的功能,在前期获得VdPKS被单拷贝T-DNA插入的微菌核发育异常突变体2H3的基础上,通过基因敲除和回补技术,经分子鉴定和表型验证,获得了2株VdPKS基因敲除突变体和3株回补突变体。研究发现野生型菌株孢子在接种到PDA培养基上培养的第6 d开始积累黑色素,而此时VdPKS基因的表达量也最高。敲除突变体虽然没有形成黑色素,却也观察到微菌核的初始结构,表明VdPKS基因不是微菌核形成的必须基因,仅参与微菌核发育后期黑色素的形成。致病力测定结果表明VdPKS基因与菌株的致病力无关。杀菌剂嘧菌酯和咯菌腈对敲除突变体菌丝生长的抑制率相对于野生型菌株和回补突变体有显著提高,表明VdPKS基因与大丽轮枝菌的抗逆性相关。 相似文献
5.
《河南农业科学》2014,(1)
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的棉花黄萎病是棉花生产上的重要病害之一,而其致病的分子机制尚不清楚,为此,以强致病力落叶型黄萎病菌FGH2为材料,利用农杆菌介导转化技术构建棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库并进行致病缺陷突变体的筛选。当农杆菌与黄萎病菌分生孢子浓度比为250∶1、承载介质为NC膜、乙酰丁香酮浓度400μmol/L、共培养时间48h时,转化效率高达每106个分生孢子产生612.5个转化子。通过采用优化后的转化体系,构建了含1 200个T-DNA插入转化子的棉花黄萎病菌突变体库。利用苗期分生孢子蘸根法测定300个转化子在棉花幼苗上的致病力,获得3个致病力显著降低的突变体181、546、1009,其中546的微菌核形成能力丧失,1009的微菌核形成能力明显下降。黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建,为棉花黄萎病菌致病及微菌核形成机制的研究奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。 相似文献
7.
pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
微菌核是棉花黄萎病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在土壤中的主要存活形式及该病的侵染源,研究土壤pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响对明确黄萎病发生具有重要意义。采用菌丝生长速率法研究培养基pH及盐分质量浓度与种类对病原菌生长及微菌核形成的影响。供试大丽轮枝菌菌丝生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌丝生长,但培养基偏碱可显著促进微菌核形成。当pH为8.0时,大丽轮枝菌菌丝生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分质量浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl质量浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl质量浓度为10g·L~(-1)时,微菌核区面积较无NaCl时增加40.7%。盐分种类影响供试大丽轮枝菌生长。随盐分质量浓度增加,氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na_2SO_4和MgSO_4)均可促进大丽轮枝菌微菌核形成,而CaCl_2则显著促进菌丝生长,并在质量浓度大于7g·L~(-1)时抑制微菌核形成。在培养环境偏碱性或氯化物和硫酸盐含盐量较高时,均可促进棉花黄萎病原大丽轮枝菌微菌核形成量增加。 相似文献
8.
采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。 相似文献
9.
10.
大丽轮枝菌可侵染660多中植物,由其引致的黄萎病具有危害性大、难于防治等特点。微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源,研究其在土壤中的分布特征及抽样技术,对于准确预测黄萎病的发生为害状况具有重要意义。土壤微菌核调查结果表明,在0~20cm土壤中,微菌核主要呈聚集或均匀分布,随密度而变化。建立的理论抽样数模型为:n=1.467 9(t/D)2 m-1.260 4。利用得到的棉田土壤大丽轮枝菌微菌核调查的序贯抽样模型计算,最多只需抽取35个样点。对各等距机械抽样方法比较后,认为实际中用双对角线取样比较合适,取样数量因土壤中微菌核的密度而异。 相似文献
11.
分离自棉花的轮枝菌“种”的鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】已知引起植物萎蔫病的轮枝菌有5个“种”,本研究旨在澄清在中国引起棉花黄萎病的轮枝菌的“种”类。【方法】从中国12个省84个县分离获得310个轮枝菌菌株,采用生物学性状观察和分子鉴定相结合的方法,对其进行“种”的鉴定。【结果】298株均产生黑色微菌核和轮枝状分生孢子梗,为典型的大丽轮枝菌,另有12个菌株培养性状较为特殊（不产生微菌核,出现黑色菌丝或厚壁孢子）,经温度敏感试验、PCR特异扩增及ITS序列进一步鉴定,2株被确定为变黑轮枝菌,其它10株被确定为大丽轮枝菌,没有出现黑白轮枝菌。【结论】在中国三大棉区,棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。但在长江流域和黄河流域棉区均分离到1株变黑轮枝菌,其在棉花黄萎病发生过程中的作用及其与大丽轮枝菌的互作还有待进一步研究。 相似文献
12.
【目的】 研究不同碳氮比(C/N)营养条件对棉花大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)主要生物学性状及致病力的影响。为调整碳氮比例减少大丽轮枝菌的为害提供理论依据。【方法】 将不同致病类型的2个大丽轮枝菌菌株在不同碳氮比的培养基上进行培养,测定大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢量、菌丝量、孢子萌发率及致病力。【结果】 不同碳氮比营养条件明显影响大丽轮枝菌落叶型菌株微菌核的形成,在低碳氮比(25∶1～30∶1)中形成的微菌核明显多于在高碳氮比(45∶1～50∶1)中形成的微菌核。25∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌产孢和菌丝生长,碳氮比高于35∶1大丽轮枝菌产孢量和菌丝生长量明显减少。40∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌的孢子萌发。在感病品种上,25∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌致病,碳氮比高于35∶1大丽轮枝菌致病力明显减弱;只有35∶1的碳氮比才有利于大丽轮枝菌致病,过高或过低的碳氮比都不利于大丽轮枝菌致病。【结论】 不同碳氮比营养条件对两种不同致病类型大丽轮枝菌的生长、繁殖及致病力都有影响,低碳氮比(25∶1)有利于大丽轮枝菌的菌核形成、分生孢子产生和菌丝生长,在感病品种上表现出较强致病性;高碳氮比(高于40∶1)不利于大丽轮枝菌生长、繁殖和致病。 相似文献
13.
[目的]筛选快速繁殖棉花黄萎病菌微菌核的适宜培养基.[方法]用6种培养基培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),通过生长速率、微菌核数量、微菌核直径和微菌核萌发率4项指标筛选合适的培养基,用5株大丽轮枝菌菌株对实验结果进行验证.[结果]改良燕麦培养基形成微菌核的数量和直径均优于其他培养基;M1和BMM培养基形成微菌核的数量较多,其微菌核直径均小于半组合培养基;验证的结果与实验结果基本一致.[结论]改良燕麦、M1和BMM培养基,根据实验需要均可作为快速繁殖微菌核的理想培养基. 相似文献
14.
为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息． 相似文献
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【目的】研究5种植物提取物和残体对大丽轮枝菌的抑制作用,为利用生物熏蒸技术防治棉花黄萎病提供依据。【方法】以棉花黄萎病主要致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)XJ2008菌株为试材,测定韭菜、葱、薄荷、藿香和薰衣草5种植物的甲醇、水提取物,对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并将植物残体以质量分数2%添加到600g基质与田园土的混合样中混匀后,测定植物残体对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。【结果】5种植物提取物均对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用,随着植物提取物质量浓度的增加,抑制作用增强,甲醇提取物的抑菌作用略强于水提取物;韭菜提取物的抑制作用最强,藿香次之。植物残体对大丽轮枝菌微菌核的萌发有明显抑制作用,其中藿香残体的抑制作用最强,薄荷、韭菜次之,薰衣草最弱。【结论】韭菜、藿香对大丽轮枝菌的抑制作用十分明显,有作为生物熏蒸材料的潜力和应用前景。 相似文献
16.
[目的]研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体.[方法]通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP),连接到pMD18-T载体上,测序验证,利用限制性内切酶HindⅢ将目的片段切下,连接到敲除载体pRF-HU2的多克隆位点上.通过电击转化法将载体转化到农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法(ATMT)转化到大丽轮枝菌.[结果]成功得到一种新的携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体,通过GFP基因的筛选,T-DNA随机插入转化子在荧光显微镜下呈现绿色,相反敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色.[结论]构建了一种大丽轮枝菌基因新的高效敲除载体,利用该载体大大节省了筛选转化子所用的时间,为大丽轮枝菌功能基因的验证提供了技术平台. 相似文献
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本文对湿筛和蔗糖悬浮两种方法在分离到大丽轮枝菌微菌核数目的稳定性及回收率(回收到大丽轮枝菌百分率)、自然病土分离效果等方面进行了比较。试验结果表明,湿筛法的稳定性好,回收率达80%;而蔗糖悬浮法的稳定性要差,回收率只有18%左右。两种方法在分离同一种自然病土时,湿筛法分离到大丽轮枝菌的数量要比蔗糖悬浮法高三倍左右,但湿筛法分离平板上杂菌显得多一些,大丽轮枝菌菌落也要小一些。而蔗糖悬浮法分离平板上大丽轮枝菌菌落要大,易于识别和计数。故在研究土壤里大丽轮枝菌动态变化与棉花黄萎病发生的关系时,综合评价宜采用湿筛法。 相似文献
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为深入研究水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum Schelcht）致病分子机理,利用根癌农杆菌介导遗传转化技术构建尖孢镰孢菌突变体库,筛选致病力降低突变体,检测其T-DNA插入数量和位点。结果表明,691个突变体库构建成功,且突变体可稳定遗传后代。选取34个不同菌落形态变化突变体测定其致病力,筛选到6个致病力降低最严重突变体,分析其菌落形态、菌落生长速率和产孢量。与野生型相比,菌落形态存在差异,其中4个突变体B9、C36、D65、E17生长速率降低,6个突变体产孢数量均降低。通过Southern blot分析发现突变体B92有两个T-DNA插入,其余5个突变体为单个T-DNA插入,利用Hi TAIL-PCR确定6个突变体T-DNA插入位点。结果有助于更好理解尖孢镰孢菌与水稻之间分子相互作用,为进一步确定尖孢镰孢菌致病基因及其功能提供参考。 相似文献
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利用农杆菌介导遗传转化(ATMT)的方法,成功构建含2 000个转化子的棉花黄萎病菌强毒菌株Vd080的突变体库。200μmol/L乙酰丁香酮(AS)作诱导剂,25℃共培养48h,棉花黄萎病菌孢子量为106 mL-1,其转化效率达150～540个转化子。进一步研究发现,供试突变体的T-DNA成功插入Vd080基因组,且均为单拷贝插入,转化子的潮霉素B基因能够稳定遗传。309个突变体中,53.7%的突变体菌落形态与初始菌株Vd080相同,均产生黑色的微菌核,不产生黑色素微菌核的菌丝型仅占17.5%。与初始菌株相比,随机选取的85个突变体,产孢量、生长速率、粗毒素分泌量及致病力发生显著变异的菌株分别占36.4%、12.9%、50.6%和29.4%,四者之间不存在明显的相关性。 相似文献
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本研究通过筛选灰葡萄孢的ATMT突变体库,获得了1株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片的致病力明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝T-DNA插入突变体。通过TAIL-PCR技术获得了T-DNA插入位点的侧翼序列,与灰葡萄孢数据库比对表明:T-DNA插入位点位于基因BC1G_02176.1的外显子2中。该基因编码区长1 206bp,含1个54bp内含子,编码383个氨基酸,基因功能未知。本研究结果为进一步研究该基因在灰葡萄孢分生孢子发育、菌核形成及致病过程中的作用奠定了基础。 相似文献