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1.
为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。 相似文献
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《林业科学研究》2019,(6)
[目的]引入细菌表达dsRNA干扰系统对中华紫胶虫FAD基因进行RNA干扰,通过检测干扰后FAD基因表达量与个体泌胶量动态变化,对FAD基因功能进行初步分析,为验证紫胶合成相关基因功能提供科学基础。[方法]中华紫胶虫FAD基因和L4440载体经双酶切之后,利用T4连接酶连接,构建FAD-L4440重组质粒,并转入HT115感受态细胞中,IPTG诱导表达dsRNA后,通过虫体涂抹法将dsRNA转染到紫胶虫体内。用RT-qPCR检测干扰后FAD基因的表达量并测定干扰后个体泌胶量的变化。[结果]RNA干扰后FAD基因表达量明显降低,其中,以低浓度菌液处理后12 h和中浓度菌液处理后24 h相对于对照组有显著差异,分别降低了90.90%和86.52%,中浓度在72 h时干扰效率高于其他两个组,个体泌胶量与对照组比较有显著下降。[结论]本研究构建了中华紫胶虫FAD基因的RNA干扰载体,在基因功能验证中引入了细菌表达dsRNA的RNAi系统,使用虫体涂抹法将其导入虫体内引起FAD基因表达量与紫胶虫个体泌胶量显著下降,为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供技术参考,为后续解析紫胶合成的分子机理提供技术基础与科学依据。 相似文献
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油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表达载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
α-桐酸合成酶是控制亚油酸向α-桐酸(18:3Δ9cis,11trans,13trans)转化的关键酶。本研究以发育中的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α-桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,长度为1221bp。通过生物信息学分析结果表明,该序列5’端和3’端非编码区序列长度分别为13bp和47bp,含有一个开放阅读框(14～1174bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域。将所得基因经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建反义表达载体pBI121fadx。 相似文献
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利用简并引物RT—PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX—AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101（含辅助质粒pJICSa—rep）侵染烟草。40d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明：从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。 相似文献
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利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草.40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量.研究结果表明:从复叶械中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG.构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达.为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础. 相似文献
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《西部林业科学》2018,(5)
以野生滇牡丹为试验材料,以其转录组数据为基础,采用反转录PCR技术克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因(Pd7GT),并通过生物信息学分析手段、基因表达对该基因进行分析。结果显示:该基因全长1 446bp (Gen Bank登录号为KX394687),可编码481个蛋白氨基酸;生物信息学分析发现Pd7GT蛋白C末端含有典型糖基转移酶识别区(WAPQV)和UDP-葡萄糖基配体绑定位点(HCGWNS)的PSPG盒子,其蛋白序列GWAPQVMILEHEAVGGFVTHCGWNSTLEGISAGLPLVTWPIFAEQFYNEK,与可可(XP_007042481)、Herrannia umbratica (XP_021298085)、毛果杨(XP_006379195)、巨桉(XP_010066837)等以葡萄糖为糖基配体的类黄酮7-O-糖基转移酶聚为一类; Pd7GT基因在组织茎中表达量最高、不同花发育时期的花谢期表达量最高、不同颜色花瓣中黄花花瓣表达量最高。本研究为滇牡丹糖基转移酶异源表达、分子育种等研究提供一定的基础,为未来通过基因工程培育具新颖花色和抗性的滇牡丹新品种提供必要材料。 相似文献
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《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2010,(11)
以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。经质粒PCR和双酶切分析,确定获得了pBI—4CLp—a4CL—aCAD反义植物表达载体。 相似文献
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[目的]探索细菌表达dsRNA介导的RNAi在美国白蛾中的可行性,为RNAi技术在美国白蛾等林业害虫上的应用提供依据。[方法]选择几丁质酶HcChi基因作为靶标,设计有效的干扰片段,构建到L4440干扰载体上,并转入HT115大肠杆菌菌株。IPTG诱导HT115表达HcChi的干扰片段,用菌液持续饲喂美国白蛾幼虫,观察幼虫生长情况,定量PCR检测HcChi的转录水平。[结果]构建了带有HcChi-L4440表达载体的HT115菌株,经IPTG诱导能够合成HcChi-dsRNA,浓缩菌液持续饲喂幼虫显著抑制HcChi的表达,相对表达量显著下降了76.7%～90.3%,幼虫生长发育迟缓,体重增长量与对照相比显著减小40.7%。[结论]成功构建HcChi RNA干扰载体,通过饲喂法在美国白蛾中获得RNAi效应。该体系首次在美国白蛾中建立,为该物种的基因功能研究和生物防治提供新思路。 相似文献
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根据其它植物PAL基因的保守区域,设计一对兼并引物,采用RT-PCR方法从国槐中克隆了一个长866 bp的PAL基因片段,命名为SjPAL.序列分析发现SjPAL多肽与其它植物的PAL氨基酸序列高度同源(87%以上),且包含与水稻和拟南芥的PAL类似的活性位点.系统进化树分析表明SjPAL与豆科植物的PAL亲缘关系较近.RT-PCR结果显示,SjPAL在根和茎的表达量约为叶中的3倍.利用反义RNA技术将SjPAL基因克隆至植物表达载体pBI121,构建了SjPAL反义RNA植物表达载体pBI121-PAL,通过根癌农杆菌EHA105将其导入拟南芥基因组,对获得的抗性植株进行PCR鉴定、Northern杂交分析、PAL活性分析以及总多酚含量和类黄酮含量分析.结果表明,该反义RNA已整合到拟南芥基因组中,转基因拟南芥的PAL基因表达量、单位材料PAL活性、总多酚含量和类黄酮含量均显著低于野生型对照.本研究为下一步利用该基因反义表达载体转化国槐,通过调节酚类物质含量提高其在再生体系中的生根能力提供了试验依据. 相似文献
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[目的]分别构建84K杨的微管蛋白TUA5和TUB16与红色荧光蛋白mCherry融合的植物过表达载体,瞬时表达验证载体在植物体内表达后的荧光信号,为研究杨树微管功能奠定基础。[方法]以毛果杨微管蛋白TUA5和TUB16的基因序列为模板,设计84K杨的皿5和7TZB76基因的引物,提取野生型84K杨的RNA并反转录成cDNA,同源克隆得到84KTUA5和84KTUB16基因,分别连接在pCAMBIA 1300载体mCh-ep荧光标签的N,端和C端,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定获得阳性单克隆,并通过电击法将重组质粒转化到农杆菌GV3101中,瞬时转化烟草后进行荧光观察。[结果]克隆得到了84KTUA5和84KTUB16基因,成功与pCAMBIA 1300-mCherry载体连接,烟草瞬时表达荧光观察结果显示:仅目的基因与mCherry标签C,端相连的融合蛋白能够成功表达,且荧光明显。[结论]成功构建了84K杨皿5和TUB16基因与pCAMBIA 1300-mCherry的融合表达载体,为进一步研究杨树微管功能提供了背景材料。 相似文献
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通过RT-PCR的方法从大肠杆菌K12中扩增出了gutD基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18 T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为780bp,包含了完整的gutD基因的编码序列,除编码区第61位密码子由CTG变为CGT和第72位密码子CTT变为CCT其它序列与所报道的修正序列一致。以BamHⅠ和HindIII限制性内切酶从克隆载体上切取gutD基因,将其连接在相应酶切的中间载体KS上,再以KpnI和BamHI酶切重组子获得具粘性末端的目的片段(gutD)与植物表达载体pCAMBIA2300连接,重组质粒通过双酶切和PCR鉴定正确后,采用直接转化法将pCAMBIA2300-gutD质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并用PCR方法进行了鉴定。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因具有对鳞翅目昆虫的毒杀作用,因此被广泛用于转基因研究,以提高植物的抗虫能力.故以含有CryIA(b)基因的PKUB质粒为模板,利用PCR技术克隆出抗虫基因[CryIA(b)],将其构建到PGEMT-Easy上,获得重组质粒PGEMT-CryIA(b),并测定全部序列,将PGEMT-CryIA(b)用BamHI 和SmaI酶切后插入表达载体PBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成准备用于丽江云杉等针叶树种遗传转化CryIA(b)基因的植物表达载体PBI-CryIA(b),采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌LBA4404和C58中,为下一步的转化工作奠定了基础. 相似文献
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[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T7启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL-1和1.152 mg·mL-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础. 相似文献
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磷脂酰肌醇合成酶PIS基因植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
磷脂酰肌醇(PI)是真核细胞中主要的磷脂组分,磷脂酰肌醇合成酶(PIS)是磷脂酰肌醇合成途径中的关键酶,它的功能是催化myo-肌醇和CDP-DG反应产生磷脂酰肌醇。将玉米PIS基因与载体pCAMBIA2300-35s连接,得到植物表达载体pCAMBIA2300-35s-PIS,该载体带有CaMV35s启动子、PIS基因、终止序列及一个CaMV35s启动子启动的NPTⅡ抗性筛选基因。将构建好的PIS植物表达载体转入农杆菌中,用于将来国槐等木本植物的转化。 相似文献
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甘氨酸甜菜碱是植物体内重要的渗透调节物质,通过逐步克隆方法,将甜菜碱合成途径中编码三个关键酶(PEAMT、CMO和BADH)的基因构建到同一表达载体中,并经过酶切检测,证明得到了正确表达载体质粒———pCBP。将pCBP转入农杆菌GV3101,用真空渗透法转化拟南芥(Col 0)植株,通过抗性筛选获得了转基因植株,PCR检测证实三个目的基因已经转入到拟南芥植株中。抗盐性检测表明,在含NaCl125mmol·L-1的1/2MS培养基上,转基因植株的生长明显优于Col 0。 相似文献
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白桦HSFA4转录因子的克隆及耐盐功能分析 总被引：2，自引：0，他引：2
《林业科学》2020,(5)
【目的】热激转录因子(HSF)在植物对非生物胁迫应答中起重要的调节作用。本研究拟从白桦中克隆获得HSFA4基因(命名为BpHSFA4),研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。【方法】在白桦转录组中筛选获得1条HSFA4基因,通过RT-PCR克隆获得BpHSFA4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析不同逆境胁迫下BpHSFA4基因在白桦叶、茎和根中的表达模式。构建植物过表达载体pROKⅡ-BpHSFA4和抑制表达载体pFGC5941-BpHSFA4,进行白桦瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染白桦作为对照。分析NaCl胁迫下不同瞬时转化白桦株系的MDA、H_2O_2、SOD、POD、相对电导率及二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定BpHSFA4基因的耐盐功能。【结果】BpHSFA4基因cDNA全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为44.15 kDa,理论等电点为5.14,具有典型HSF结构域。非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)条件下和激素(ABA、GA_3和JA)处理下,BpHSFA4基因的表达均发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显上调或者下调,其中盐胁迫下表达变化尤为明显。3种瞬时表达白桦株系中的BpHSFA4基因的表达分析结果显示成功获得了瞬时过表达转基因株系(OE)和抑制表达转基因株系(SE)。进一步对不同转基因白桦株系的生理指标和生理染色进行分析,结果显示:Na Cl胁迫条件下,过表达BpHSFA4植株H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率明显低于对照植株,抑制表达BpHSFA4植株的H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率则明显高于对照植株;过表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显高于对照植株,而抑制表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显低于对照株系;NBT、DAB染色结果与H_2O_2含量测定结果一致,显示OE植株的着色明显比对照植株浅,而抑制表达株系着色明显比对照植株深,Evans blue染色结果和MDA含量测定结果一致。【结论】BpHSFA4基因能对非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)和激素(ABA、GA_3和JA)处理做出应答,特别是盐胁迫条件下,应答强烈,该基因可能参与白桦耐盐胁迫应答。在盐胁迫条件下,瞬时过表达BpHSFA4基因株系能通过提高SOD和POD等保护酶的活性从而增强活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度,减少细胞受损或细胞死亡,进而提高白桦的耐盐能力。本研究初步证实BpHSFA4基因是一个耐盐胁迫应答候选基因。 相似文献
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《热带农业科技》2020,(4)
淀粉酶是生物体内参与淀粉水解的一类重要酶,分析橡胶树炭疽菌HK-36菌株α-淀粉酶基因家族的生物学信息可为深入研究炭疽菌α-淀粉酶基因功能打下基础。本研究借助炭疽菌HK-36菌株基因组测序数据,利用生物信息学方法鉴定其α-淀粉酶基因家族,对比分析该菌α-淀粉酶家族成员的基因结构、预测蛋白的理化性质和结构、在炭疽菌亚细胞的定位、启动子元件,构建蛋白三维模型和邻接法进化树。鉴定到5个CgAmys基因,α-淀粉酶家族成员的基因推定的蛋白含有500～549个氨基酸,分别定位于溶酶体、质膜、内质网、过氧物酶体和线粒体中,多为亲水性、酸性蛋白;CgAmys推定蛋白的N端由延长链和螺旋结构组成,C端基本由延长链组成;CgAmys的编码蛋白包含典型的Glyco＿hydro＿13＿cat＿dom(IPR006047)结构域,属于糖基水解酶家族13;CgAmys基因启动子上含有大量非生物逆境诱导和激素的顺式作用元件,其中光响应、生长素和茉莉酸诱导有关元件数量最多。橡胶树炭疽菌α-淀粉酶家族基因可能在不同生育期受光照和多种激素调控,并参与炭疽菌对多种逆境的应答调控。该研究有助于进一步解析橡胶树炭疽菌CgAmys基因家族在生长发育及逆境胁迫响应中的功能。 相似文献