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1.
《果树学报》2016,(2)
【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。 相似文献
2.
甜樱桃SFB4与SFB4’基因的鉴别 总被引：7，自引：0，他引：7
本研究以最近发现的李属花粉决定子候选基因“S 单元型特异F-box蛋白基因(SFB ) ”为基础, 根据甜樱桃SFB 4基因设计引物, 从自交不亲和‘雷尼’和‘佳红’以及自交亲和的‘斯坦拉’总DNA中分别扩增出SFB 4和SFB 4’基因的部分序列。经测序结果发现: SFB 4’基因比SFB 4基因缺失了4个碱基TAAA。根据这个缺失差异, 设计了一对引物BFP200和BFP201, 这对引物只能扩增SFB 4’基因,而不能扩增SFB 4基因, 从而利用SFB 基因区分开了甜樱桃自交不亲和的S4和自交亲和的S4’单元型。 相似文献
3.
《果树学报》2015,(6)
【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。 相似文献
4.
《果树学报》2017,(2)
【目的】分离沙梨DELLA蛋白编码基因PpGAI3,探究其蛋白在花芽休眠中的表达情况。【方法】从不同需冷量沙梨品种‘蜜雪梨’和‘黄花梨’中分离PpGAI3基因,重组到p EASY-Blunt E1表达载体中,转化BL21(DE3)宿主菌后经IPTG诱导表达,并对表达菌株进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】获得2种沙梨的PpGAI3基因,分别命名为PpGAI3mx和PpGAI3hh,Gen Bank登录号为KU954535和KX078215,其开放阅读框(ORF)为1 641 bp,编码546个氨基酸,预测其为亲水性不稳定蛋白。进化树分析表明PpGAI3mx和PpGAI3hh与白梨的亲缘关系最近;成功构建了p EASY-Blunt E1-PpGAI3原核表达载体,得到蛋白分子质量约60 ku的诱导表达产物。【结论】所得沙梨DELLA蛋白编码基因PpGAI3为植物DELLA蛋白家族中的成员,在梨花芽休眠过程中具有特异表达,且表达产物大部分以不溶性包涵体形式存在。 相似文献
5.
甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。 相似文献
6.
【目的】分析‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉蛋白差异,探讨‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变的机制。【方法】以‘鸭梨’及其自交亲和性芽变‘金坠梨’花粉为材料,利用双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE)对二者花粉总蛋白进行分离,并对差异蛋白进行功能和质谱分析,通过qRT-PCR进行相关差异基因的表达验证。【结果】分离得到23个差异蛋白,其中14个蛋白在‘金坠梨’中上调表达,9个蛋白在‘金坠梨’下调表达;对其中差异显著的10个蛋白点质谱检测结果表明,1个为半胱氨酸甲基转移酶(cysteine S-methyltransferase,4 803),1个为存储蛋白(Storage protein,5413),4个为蛋白酶类:果糖激酶(fructokinase,5 316)、顺乌头酸水合酶(aconitate hydratase,5 811)、烯酰-ACP-还原酶(Enoyl-ACP reductase,7 303)和JPR ORF1蛋白(JPR ORF1 protein,7 506),4个为HSP家族蛋白:HSP70伴侣26(HSP70-type chaperone 26,8 633)、HSP 90.5(8 822)和2个ER结合蛋白(ER-binding protein,4 209和8 805)。这些蛋白涉及到遗传信息处理、碳水化合物代谢、能量代谢、酶和氨基酸代谢等生理过程;qRT-PCR对8个基因进行验证,发现部分基因在蛋白水平与基因表达水平有明显差异。这些差异的蛋白在不同的信号途径中参与了‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变。【结论】明确了‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉侧自交亲和性突变中差异表达蛋白,为进一步研究梨亚科自交不亲和性的调控机理提供理论依据。 相似文献
7.
【目的】系统研究‘鸭梨’及其花粉部分自交亲和性突变体‘金坠梨’花粉基因表达情况,筛选二者之间的差异表达基因,为进一步揭示‘金坠梨’自交亲和性突变的分子机制提供数据支持。【方法】以‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉为材料,采用Illumina高通量测序技术进行转录组测序分析,利用生物信息学方法分析二者的差异表达基因,并利用q RTPCR验证转录组测序结果。【结果】‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉转录组测序的干净读序(clean reads)分别为44 778 208条和44 995 100条。2个样品Reads与参考基因组的比对效率分别为66.35%和66.08%,并且唯一比对位置的数量都超过55.02%。数据分析显示,‘鸭梨’花粉样品与‘金坠梨’花粉样品显著差异表达基因的数目是136个,其中上调表达数量是76个,下调表达基因数量是60个,涉及一些自交不亲和、泛素化、抗逆境胁迫、RNA降解及转录等相关基因。q RTPCR结果表明,转录组测序数据可信度很高。挖掘转录组和q RT-PCR数据,发现了一个差异表达在40倍以上的泛素结合酶E2同源基因(基因号:103966960)。【结论】明确了‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉部分自交亲和性突变中差异表达的基因,为进一步大量挖掘在梨属果树自交不亲和机制中发挥重要作用的基因奠定基础。 相似文献
8.
以黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因为目的基因,以大肠杆菌DH5α为表达载体体外操作寄主菌,农杆菌LBA4404为最终双元载体寄主菌。将RT-PCR获得的目的基因片段连接到pMD18-Tsi mple Vectoer上,冻融法转化到大肠杆菌扩繁后,经限制性核酸内切酶酶切插入表达载体适宜酶切位点上,重组质粒DNA经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中得到工程菌,完成含目的基因的双元载体构建,为培育抗CMV病毒的番茄品种打下基础。 相似文献
9.
香蕉miR408b靶基因Chemocyanin的克隆及其在低温胁迫下的表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《果树学报》2020,(1)
【目的】研究香蕉中miR408b及其靶基因Chemocyanin在低温胁迫下的表达模式和调控机制。【方法】以三明野生蕉和‘天宝蕉’叶片为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得三明野生蕉中的MiChemocyanin基因(MiCHY)和‘天宝蕉’中的MaChemocyanin基因(MaCHY),利用在线网站对MiCHY进行生物信息学分析。【结果】MiCHY基因的cDNA全长为587 bp,开放阅读框381 bp,编码126个氨基酸蛋白,具有Plantacyanin结构域,属于超铜氧化还原蛋白家族。在ORF区的4～24 bp处有一处高度匹配miR408b的结合区(GCTCAGGGAAGGGGCAGTGCG)。RLM-5’RACE分析表明,miR408b主要在靶序列的第7～8个碱基之间剪切靶基因MiCHY的mRNA。序列比对发现,MaCHY基因比MiCHY基因多了82 bp的序列,符合内含子的GT-AG剪切,推测发生了内含子驻留的可变剪接。保守结构域分析表明MaCHY没有Plantacyanin结构域,但也属于铜氧化还原蛋白家族。qRT-PCR结果表明,低温胁迫下,冷敏感的‘天宝蕉’miR408b的表达量上升,MaCHY的表达量降低;在抗寒的三明野生蕉中,miR408b的表达量下降,MiCHY表达量上升,miR408b与MiCHY表达量呈负相关。【结论】miR408b及其靶基因MiCHY可能在香蕉响应低温胁迫中发挥重要作用。 相似文献
10.
柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《果树学报》2015,(3)
【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。 相似文献
11.
【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。 相似文献
12.
八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。 相似文献
13.
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《果树学报》2016,(8)
【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。 相似文献
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【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。 相似文献
16.
应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。 相似文献
17.
利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。 相似文献
18.
【目的】克隆在采后‘秋姬李’果皮积累花色苷过程中高表达的MYB抑制因子PsMYB18基因,研究其序列特征、表达特点与功能。【方法】以‘秋姬李’为试材,采用qRT-PCR分析不同温度和光照处理条件下‘秋姬李’果皮中PsMYB18基因的转录水平,采用RT-PCR克隆PsMYB18基因,并通过烟草叶片瞬时表达试验分析PsMYB18的功能。【结果】q RT-PCR分析表明20℃和光照处理可促进‘秋姬李’果皮PsMYB18基因表达。PsMYB18基因的开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸的蛋白。进化树分析表明PsMYB18与其他植物的花色苷合成抑制因子亲缘关系较近。序列比对结果表明其具有保守的R2R3结构域和抑制基序C1和C2。烟草瞬时表达试验表明,PsMYB18可抑制正调控因子PsMYB10.1和PsbHLH3的花色苷合成诱导功能。【结论】‘秋姬李’PsMYB18为花色苷合成抑制因子。 相似文献
19.
《果树学报》2016,(5)
【目的】探究高抗霜霉病的中国山葡萄‘双红’中胺氧化酶(VaAO)在抗葡萄霜霉病中的作用。【方法】以中国山葡萄‘双红’为试材,采用RT-PCR技术,克隆山葡萄‘双红’的AO基因,命名为VaAO;利用RT-qPCR在转录水平上分别检测了抗病的山葡萄‘双红’和感病的欧亚种葡萄‘赤霞珠’接种霜霉菌后AO的表达模式;通过农杆菌介导的瞬时转化法,使VaAO分别在本氏烟草和葡萄‘赤霞珠’中瞬时过表达;利用DAB染色法,检测H_2O_2的积累。【结果】VaAO基因的开放阅读框(ORF)长2 184 bp,编码727个氨基酸。经BLAST比对发现VaAO氨基酸序列与欧亚种葡萄‘黑比诺’的氨基酸序列同源性高达99%。定量结果表明:抗病的‘双红’和感病的‘赤霞珠’的AO基因均受到霜霉菌诱导,且相对表达量都在接种72 h后达到最高峰。值得注意的是,VaAO在接种后24 h表现出显著上调。VaAO在烟草中瞬时表达后发现其蛋白定位在细胞核和细胞膜中。VaAO在‘赤霞珠’叶片中瞬时过表达能够显著提高叶片中H2O2的积累和抵抗霜霉病的能力。【结论】成功克隆了山葡萄‘双红’的VaAO基因,定量分析和瞬时表达均表明VaAO基因在参与葡萄抗霜霉病的过程中发挥了重要作用。 相似文献
20.
《果树学报》2015,(4)
【目的】分离和克隆梨过敏原蛋白基因Ppmal(Gen Bank登录号为KP008110),探讨其在梨果实发育过程中的功能。【方法】以砂梨品种‘翠冠’[Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai]为试材,在盛花期后30 d对植株果柄进行涂抹赤霉素处理,利用同源克隆和RACE方法克隆目的基因全长序列,并通过实时荧光定量技术和半定量技术分析该基因在梨不同组织以及梨果实发育过程中的表达变化。【结果】Ppmal的全长是906 bp,含有480 bp的开放阅读框(ORF),编码159个氨基酸,预测的蛋白质相对分子质量为17.56 k D,等电点为5.62。生物信息学分析显示该基因没有信号肽序列,没有跨膜结构域,具亲水性。与其他物种的过敏原蛋白基因核苷酸序列同源性超过75%,与苹果和西洋梨编码的氨基酸序列同源性分别高达97.48%和96.23%,进化树分析表明该基因与苹果的进化关系最近。同时,定量结果显示经过赤霉素处理后的果实中该基因的表达量随着果实的生长发育呈现先降低后升高的趋势,并且具有组织差异表达的特点,其表达量在叶片中最大,其次是嫩叶,再次是花,枝条最低。【结论】获得梨Ppmal基因全长,对该基因在砂梨品种‘翠冠’发育过程中的表达分析显示,Ppmal受到赤霉素的调控,并在砂梨果实膨大期发生上调表达。 相似文献